ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 35900.1—2018 动物流感检测 第1部分：H1亚型流感病毒核酸荧光 RT-PCR检测方法 Animal influenza detection-Part 1.Method of real-time RT-PCR for the detection of H1 subtype influenza virus 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35900.1—2018 前言 GB/T35900《动物流感检测》目前分为3个部分 第1部分：H1亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法； 一第2部分：H3亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法； —第3部分：H1和H3亚型流感病毒核酸双重荧光RT-PCR检测方法。 本部分为GB/T35900的第1部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本部分由中华人民共和国农业部提出。 本部分由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本部分起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国农业大学。 本部分主要起草人：乔彩霞、谷强、高志强、刘环、蒲静、张鹤晓、刘金华、孙洪磊、张伟、张利峰。 1 GB/T35900.1—2018 引 言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到本文件4.1.8与“检测H1和H3亚型 流感病毒的核苷酸序列和试剂盒”相关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意向任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得： 专利持有人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局 地址：北京市朝阳区甜水园街6号。 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。 I GB/T 35900.1—2018 动物流感检测 第1部分：H1亚型流感病毒核酸荧光 RT-PCR检测方法 1范围 本部分适用于猪和禽及其产品中H1亚型流感病毒核酸的检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 荧光RT-PCR实时荧光反转录聚合酶链反应（real-timereversetranscriptpolymerasechainre- action) Ct(或 Cp)值 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（cyclethreshold，or crossing point) cRNA 互补RNA(complement RNA) DEPC 焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） FAM 羧基荧光素（carboxyfluorescein） LNA 锁核酸（locked nucleicacid) PBS 磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline） RNA 核糖核酸（ribonucleicacid) TAMRA 羧基四甲基罗丹明（carboxytetramethylrhodamine) 4试剂和材料 4.1试剂 4.1.1 总则：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装， 4.1.2TRIzol:2℃~25℃保存。 4.1.3氯仿：2℃~8℃预冷。 4.1.4异丙醇：-20℃预冷。 1 GB/T35900.1—2018 4.1.5DEPC水:见附录A中A.1。 4.1.6 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷 4.1.7 PBS（含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素）：配方见A.2。 4.1.8引物、探针序列及反应液配方：见附录B。 4.1.9阳性对照为灭活的H1亚型动物流感病毒或体外转录的H1亚型流感病毒HA基因cRNA溶 液；阴性对照为已知流感病毒阴性的动物组织悬液 4.2 仪器设备及耗材 4.2.1 荧光PCR检测仪及配套反应管（板）。 4.2.2 高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12000r/min）。 4.2.3台式离心机。 4.2.4振荡器。 4.2.5 组织匀浆器。 4.2.6 冰箱（2℃～8℃和-20℃两种）。 4.2.7 微量移液器（5μL、10μL、100μL、1000μL）及配套吸头（无核酸酶）。 4.2.81.5mL离心管（无核酸酶）和5mL采样管。 5实验室的标准化设置与生物安全管理 本方法的实验室设置与管理见GB/T19438.1一2004附录C：实验室生物安全管理见GB19489。 6样品的采集与前处理 6.1总则 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套 6.2采样及处理工具 6.2.1采样专用商品化棉拭子、剪刀、镊子、研钵、5mL采样管、一次性采样袋， 6.2.2除棉子和采样袋外，上述取样工具应经121℃土2℃，15min高压灭菌并烘干或经160℃干 烤2 h。 6.3样品采集 6.3.1拭子样品 活动物采集拭子样品。根据动物种类可采集咽喉拭子、泄殖腔拭子（禽类）或鼻子（猪）。采集方 法如下： 取咽喉拭子时将拭子深入喉头及上颚裂来回刮2次～3次并旋转，取分泌液； 一取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔旋转一圈并活取少量粪便： 一取鼻拭子时将拭子深人鼻腔来回刮2次～3次并旋转，取分泌物 6.3.2组织样品 病死动物采集肺脏或气管等组织。用无菌剪、镊采集待检组织，装人一次性采样袋或其他灭菌容 2 SAC