ICS 11.220 SN CCS B 41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5338—2021 虎物种鉴定 实时荧光PCR方法 Identification for tiger species-Real-time PCR method 2021-06-18发布 2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5338—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国宁波海关、中华人民共和国绍兴海关 本文件主要起草人：吴姗、赵秀玲、张明哲、虞惠贞、尹文秀、张晓峰、任明兴、孙超、张荃。 SN/T 5338—2021 虎物种鉴定 实时荧光PCR方法 1范围 本文件规定了虎种（Pantheratigris）的实时荧光PCR鉴定方法。 本文件适用于虎种内现存的6个亚种虎，包括东北虎（Pantheratigrisaltaica）、华南虎（Panthera tigrisamoyensis）、孟加拉虎（Pantheratigristigris），印度支那虎（Pantheratigriscorbetti）、马来虎 （Pantheratigrisjacksoni）和苏门答腊虎（Pantheratigrissumatrae）及其制品的定性鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1. 1 实时荧光PCRreal-timePCR 在PCR扩增时加入带有荧光基团的特异性探针（Taqman探针）或荧光染料，使PCR产物的积累 与荧光信号的积累完全同步，实现PCR产物的实时监测。 3.1.2 Ct 值cycle threshold value 每个反应管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数。 准信息服 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（basepair） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate) EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid) FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein） OD：光密度值（opticaldensity） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） ROX：羧基-X-罗丹明（carboxy-X-rhoamine) SN/T 5338—2021 Taq酶：从水生热栖菌中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶（thermus aquaticu） TE:Tris-HCI、EDTA缓冲液 Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane 4试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。试验用水应符合GB/T6682中一级水的规定。所有试 剂均用无DNA酶污染的容器分装。 4.1液氮。 4.20.5mol/LEDTA缓冲液(pH8.0)。 4.3 CTAB裂解液(2. 0%):20 g/L CTAB,0.1 mol/L Tris-HCI(pH 8.0),1.4 mol/L NaCl, 20 mmol/L EDTA(pH 8. 0)。 4.4CTAB沉淀液(0.5%):5g/LCTAB,40mmol/LNaCl。 4.5 蛋白酶K溶液（20mg/mL）。 4.6 NaCl溶液(1.2mol/L)。 4.7 RNase A酶。 4.8 三氯甲烷。 4.9异丙醇。 体积分数为70%的乙醇。 文本为准 4.10 4. 11 TE缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),1 mmol/L EDTA缓冲液(pH 8.0)。 4.12 实时荧光PCR反应混合液：10μL反应体系包括：1U～2U(unit，酶学单位）的Taq酶、1XPCR 缓冲液、2. 5 mmol/L~4. 0 mmol/L的 Mg+、0. 2 mmol/L的 d(A,C,G)TPs、0. 2 mmol/L~ 0.4mmol/LdUTP、400mmol/LROX染料（某些荧光PCR仪不需要ROX校正）。如果具有等效的 商品化试剂盒，则可使用这些等效产品。 4.13引物与探针：虎种的实时荧光PCR检测所用的引物和探针序列见表1。 表1 引物和探针序列 名称 序列 目的基因名称及序列号 扩增片段长度 虎5°端引物 5'-CTACCCRCCCCATCCAATAT-3' 线粒体的Cytb基因， 虎3'端引物 166 bp 5'-GTAGTTTACGTCGCGGCAAA-3' JF357968.1 虎探针 5'-FAM-TCACTGGCCTCTTTCTAGCC-ECLIPSE-3' 服务平台 注：虎引物探针扩增的靶标序列见附录A。虎种信息见附录B. 5 仪器设备 5.1实时荧光PCR仪。 5.2恒温水浴锅或干式恒温器。 5.3离心机：最大离心力不小于16000g。 5.4微量移液器：2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。 5.5核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 5.6 pH计。 2 SN/T 5338—2021 5.7涡旋振荡仪。 5.8研钵。 5.9冷冻粉碎均质装置。 5.10天平：感量0.01g。 5.11高压灭菌器。 5.12锉刀或电钻。 6检验步骤 6.1制样 6.1.1肌肉、内脏等组织：取适量（由于制备一份DNA样本至少需要200mg的样本，考虑到制备时的 损耗和重复，可取1g左右的样品）样品放入研钵，用液氮（4.1）充分研磨至糜状；或采用合适的冷冻粉 碎均质装置（5.9）对样品进行充分地研磨至状。 6.1.2血液：可直接进行DNA提取，无需制样。 6.1.3骨骼、牙齿（带牙髓）：使用锉刀或电钻（5.12）等工具，将样品制备成粉末状。 6.1.4毛发（带毛囊）：采用冷冻粉碎均质装置（5.9）对样品进行充分地研磨至粉末状。 6.2脱钙处理 上述6.1涉及的样品，牙齿样品需进行脱钙处理，其余样品制样后可直接进人6.3.1的DNA提取 步骤。 取制备好的粉末状牙齿样品200mg于2mL离心管中，加入1.5ml0.5mol/LEDTA缓冲液 (pH8.0)（4.2）,37℃恒温12h15000g离心1min，弃尽上清。脱钙处理后的样品可进入6.3.1的 DNA提取步骤。 6.3样品DNA提取 CTAB裂解液（4.3）和10uL蛋白酶K溶液（4.5），振荡混勾65℃恒温30min，期间每隔10min振荡 混匀。 6. 3.2 215000g离心10min，取上清至一新的离心管，加人300μL三氯甲烷（4.8），涡旋振荡充分混 匀，15000g离心10min。 6.3.3取上清至新的离心管中，加入2倍体积0.5%CTAB沉淀液（4.4），颠倒混匀，室温静置1h， 15000g离心5min，弃尽上清。 6.3.4加人400μL1.2mol/LNaCl溶液（4.6），室温放置10min，使DNA全部溶解，加人10μL RNaseA酶(4.7),37℃恒温20min。 6.3.5加入400μL三氯甲烷（4.8），涡旋振荡混匀，15000g离心10min，取上清至新的离心管，加入 0.7倍体积的异丙醇（4.9），颠倒混匀，室温静置10min，15000g离心10min 6.3.6弃尽上清，加人500μL70%乙醇，颠倒混匀，15000g离心2min，弃上清。重复一次。 6.3.7短暂离心，将残余上清液吸尽，将DNA晾干。加入20μL～100μLTE溶液（毛发、牙齿、骨骼、 血液等加人20μL左右；肌肉、内脏等加入100μL左右），使DNA完全溶解。DNA样品保存于20℃ 备用。 6.3.8毛发、牙齿、骨骼、血液等组织宜采用相关试剂盒提取DNA。 3