ICS 11.220 B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7214.1—2011 鱼类爱德华氏菌检测方法 第1部分：迟缓爱德华氏菌 Detection methods for Edwardsiella from fish- Part 1: Edwardsiella tarda 行业标准信息服务平台 2011-09-01 发布 2011-12-01实施 中华人民共和国农业部发布 SC/T 7214. 1—2011 前 言 SC/T7214—2011《鱼类爱德华氏菌检测方法》分为3部分： 第1部分：迟缓爱德华氏菌； 第2部分：爱德华氏菌； 第3部分：保科爱德华氏菌。 本部分为SC/T7214--2011的第1部分。 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本部分起草单位：中国水产科学研究院珠江水产研究所。 本部分主要起草人：赵飞、姜兰、邹为民、谭爱萍、陆小苕、罗理、王伟利。 行业标准信息服务平台 SC/T 7214.1—2011 鱼类爱德华氏菌检测方法 第1部分：迟缓爱德华氏菌 1范围 本部分规定了鱼类迟缓爱德华氏菌的采样程序、细菌鉴定方法与结果判定指标。 本部分适用于鱼类迟缓爱德华氏菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T4789.28-2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB/T18652致病性嗜水气单胞菌检验方法 SC/T7014一2006水生动物检疫实验技术规范 3试剂、染色液与培养基 检验中所需试剂、染色液与培养基的配制按GB/T4789.28、GB/T18652或SC/T7014中的规定 执行；聚合酶链式反应（PCR)测定用水应符合GB/T6682中一级水的规格，且要用焦炭酸二乙酯 (DEPC)处理水(A.1)，上述未提及的见附录A。 16SrRNA基因 DNA序列扩增引物，P1：5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3',P2：5'- GGTTACCTTGTTACGACTT- 3',一20℃保存。 4设备和器械 超净工作台、生物显微镜、PCR仪、电泳仪、微生物检测必备辅助设备和器械等。 5细菌分离与培养 5.1取样 取鱼的肝、肾及病灶组织。 从取样组织中直接分离接种；在无菌环境中将样品置于无菌离心管中，用无菌盐水冲洗并捣碎，然 后分离接种。 5.2分离培养 样品接种在血液琼脂平板（按GB/T4789.28一2003中4.6规定的方法配制），按常规法划线。 28℃培养24h～48h。然后，从中挑取灰白色、圆形、湿润、呈半透明状的单菌落在普通营养琼脂平板 （按GB/T4789.28—2003中4.7规定的方法配制)进行纯化培养。 6革兰氏染色 按GB/T4789.28--2003中2.2的规定执行。 1 SC/T 7214. 1—2011 7生理生化试验 7.1硫化氢试验 按GB/T4789.28-—2003中3.14的规定执行。培养基变黑色为阳性，不变黑色为阴性。 7.2运动性试验 半固体琼脂按GB/T4789.28-2003中4.30的方法配制。把待检菌穿刺接种于半固体琼脂，28℃ 培养24h。若待检菌由穿刺线向四周扩散，其边缘呈云雾状，为运动性阳性；若待检菌只生长在穿刺线 上，边缘十分清晰，为运动性阴性。 7.3氧化酶试验 以毛细管吸取四甲基对苯二胺的1%水溶液滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性， 不变色为阴性。 7.4丙二酸盐利用试验 按GB/T4789.28一2003中3.7的规定执行。培养基由绿色变为蓝色为阳性，不变蓝色为阴性。 7.5吲哚试验 按SC/T7014一2006表2的吲哚（靛基质）试验的规定执行。培养基变红色为阳性，不变红色为阴 性。 7.6甲基红(M.R)试验 性。 7.7赖氨酸脱羧酶试验 按GB/T4789.28一2003中3.12的规定执行。试验管培养基呈紫色、对照管培养基呈黄色为阳 性，试验管培养基不呈紫色、对照管培养基呈黄色为阴性。 7.8β-半乳糖苷酶(ONPG)试验 按GB/T4789.28一2003中3.3的规定执行。培养基变黄色为阳性，不变黄色为阴性。 7.9糖、醇类(D-葡萄糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、D-甘露醇)发酵试验 将待检菌穿刺接种于糖、醇类发酵试验培养基（配制方法见A.2）,28℃培养24h后观察。培养基 变黄色为阳性,不变黄色为阴性。 816SrRNA基因DNA的序列测定和同源性分析试验 8.1DNA提取 8.1.1将5.2分离纯化的待检菌接种于普通营养液体培养基中，以28℃摇床培养24h。 8.1.2取2mL待检菌培养液，12000r/min离心1min，收集菌体。 8.1.3菌体悬浮于500μLTE缓冲液（pH8.0)（A.3)，振荡悬浮，加人50μL10%的SDS溶液（A.4)， 10μL20mg/mL的蛋白酶K（A.5）,混匀,37℃温育1h。 混匀，65℃温育20min。 8.1.7取上清液，加人1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，10000r/min离心10min；沉淀 用70%酒精洗涤2次，室温晾干。 8.1.8加人50μuL的TE缓冲液溶解，一20℃贮存，备用。 2 SC/T 7214. 1-2011 8.216SrRNA 基因 DNA序列扩增 8.2.1 在 PCR 管中加 10 X PCR 缓冲液（无 Mg2+）5.0 μL,MgCl²（25 mmol/ L)5.0 μL,dNTPs (10 mmol/L)1. 0 μL,引物(20 μmol/L)P1 和 P2 各 1. 0 μL,Taq DNA 酶(5 U/ μL)0. 5 μL,DNA 模板 1.0μL，无菌双蒸水35.5μL。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。如果使用无 热盖的PCR扩增仪，需在反应混合物上覆加2滴矿物油。混匀后，3000r/min离心30s。 8.2.2将反应管置于PCR扩增仪，按下列程序进行PCR扩增：94℃预变性2min;94℃变性45s,52℃ 退火1min，72℃延伸1min，35次循环；72℃延伸7min;4℃保温。 8.3琼脂糖凝胶电泳 8.3.1用TAE电泳缓冲液（A.10)配制1%的琼脂糖(含0.5ug/mLEB或相应浓度的EB替代品)平 板，凝固后放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将上述6μL样品和2μL溴酚蓝指示剂溶液 (A.11)加人样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照。 8.3.2120V电泳约20min，当溴酚蓝到达底部时停止。于紫外光下观察电泳条带的数量和位置。 8.3.3在长波紫外灯下用刀片切下含有目的条带（约1500bp)的胶块，放人无菌离心管中称重。 8.4PCR扩增产物纯化、测序及序列比对 8.4.1PCR扩增产物纯化 8.4.1.1按每0.1g琼脂糖凝胶加0.1mL酚,将酚加人8.3.3含有目的条带胶块的离心管中。 8.4.1.2经漩涡混匀器振荡1min～2min，将离心管在一70℃放置1h，使凝胶完全冻结。 8.4.1.337℃水浴将冻结的凝胶融化后，在漩涡混匀器上振荡1min～2min;14000r/min离心5min。 12 000 r/min离心5min。 8.4.1.5取上清液加人等体积的氯仿：异戊醇（24：1)（A.9），混匀，12000r/min离心5min。 夜或一70℃放置1h～2h。 8.4.1.714000r/min离心10min，弃上清。 8.4.2将8.4.1纯化的PCR扩增产物进行序列测定,并与参考序列(附录B)进行比对分析。 9结果判定 9.1菌落形态 28℃培养24h～48h,形成圆形、隆起、灰白色、湿润并带有光泽、呈半透明状的菌落。 9.2细菌染色 革兰氏染色为阴性。 行业标准 9.3生理生化反应试验 生理生化反应试验见表1。 表1 反应项目 结果 反应项目 结果 反应项目 结果 反应项目 结果 硫化氢 + 运动性 + 氧化酶 丙二酸盐利用 吲哚 + 甲基红 赖氨酸脱羧酶 + β-半乳糖苷酶 蔗糖 D-葡萄糖 + L-阿拉伯糖 海藻糖 D-甘露醇 3 SC/T 7214. 1—2011 416SrRNA基因DNA的序列测定和同源性分析试验 9. 4 测定的16SrRNA基因DNA序列与附录B所列的基因序列比较,同源性达98%以上。 10 综合判定 符合以下所有特征者判定为迟缓爱德华氏菌： 菌落形态和细菌染色观察与9.1和9.2相符； 生理生化反应结果与9.3相符； 16SrRNA基因DNA的序列测定和同源性分析结果与9.4相符。 行业标准信息服务平 4 SC/T 7214. 1—-2011 附录A （规范性附录） 培养基和试剂配制方法 A.1焦炭酸二乙酯(DEPC)处理水 0.1%DEPC处理一级水（GB/T6682)，剧烈震荡后，放置数小时，121℃,30min灭菌除去DEPC， 分装。 A.2糖、醇类发酵培养基 蛋白陈 2 g NaCI 5g 0.2 g K, HPO4 10 g 被测糖或醇类 琼脂 6g 溴百里酚蓝1%水溶液3mL （溴百里酚蓝先用少量95%乙醇溶解后，再加水配成1%的水溶液） 蒸馏水 1 000 mL pH7