ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 548—2015 代替NY/T548—2002 猪传染性胃肠炎诊断技术 Diagnostic techniques for transmissible gastroenteritis 行业标准信息服务平台 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 548—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T548—2002《猪传染性胃肠炎诊断技术》。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 本标准主要起草人：冯力、陈建飞、时洪艳、张鑫 本标准的历次版本发布情况为： NY/T 548-—2002。 行业标准信息服务平台 I NY/T548—2015 猪传染性胃肠炎诊断技术 1范围 本标准规定了猪传染性胃肠炎的病原学检测和血清学检测。病原学检测包括病毒分离鉴定、直接 免疫荧光法、双抗体夹心酶联免疫吸附试验和反转录一聚合酶链式反应。血清学检测包括血清中和试 验和间接酶联免疫吸附试验。 本标准适用于对猪传染性胃肠炎的诊断、产地检疫及流行病学调查等。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 猪传染性胃肠炎transmissiblegastroenteritis，TGE 猪传染性胃肠炎是由尼多目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronauiridae）、α-冠状病毒属的猪传染 性胃肠炎病毒（transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)引起的猪的一种急性、高度接触传染性的肠 道疾病，以呕吐、水样腹泻、脱水和10日龄以内仔猪的高死亡率为主要特征。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE：cytopathiceffect细胞病变作用。 DIA：directImmunofluorescenceassay直接免疫荧光法。 ELISA：enzyme-linked immunosorbent assay酶联免疫吸附试验。 PBS:phosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液。 PRCV：porcinerespiratorycoronavirus猪呼吸道冠状病毒。 TGE：transmissiblegastroenteritis猪传染性胃肠炎。 RT-PCR：reversetranscription-polymerasechainreaction反转录一聚合酶链式反应。 5临床诊断 5.1流行特点 TGE的发生和流行有暴发流行、地方流行和周期性地方流行3种形式。若感染了TGEV的变异 株PRCV，则会出现不同的流行模式，从而使TGEV的流行更加复杂化。本病一年四季均可发生，一般 多发生在冬季和春季，有时也发生于夏季、秋季。各种年龄的猪均可感染，尤其是10日龄以内的哺乳仔 猪，发病率和死亡率可高达100%。病猪、带毒猪和隐性感染猪是本病的主要传染源。病毒通过粪一口 1 NY/T548—2015 途径、气溶胶或感染母猪的乳汁进行传播。 5.2临床症状 现因猪龄大小而异，新生仔猪的典型症状是呕吐、水样腹泻、脱水、体重迅速下降，导致新生仔猪高发病 率和高死亡率。腹泻严重的仔猪，常出现未消化的乳凝块。粪便臭，病程短，症状出现后2d～7d死 亡。泌乳母猪发病，则一过性体温升高、呕吐、腹泻、厌食、无乳或泌乳量急剧减少，小猪得不到足够乳 汁，进一步加剧病情，营养严重失调，增加了小猪的病死率。3周龄仔猪、生长期猪和出栏期猪感染时仅 表现厌食，腹泻程度较轻，持续期相对较短，偶尔伴有呕吐，极少发生死亡。 5.3病理变化 TGEV引起的腹泻，尽管症状很严重，但是病理变化较轻微。肉眼可见的病理变化常局限于消化 道，特别是胃和小肠。胃膨胀，胃内充满凝乳块，胃黏膜充血或出血，胃大弯部黏膜淤血。小肠壁弛缓、 膨满，肠壁非薄皇半透明。小肠内容物呈黄色、透明泡沫状的液体，含有凝乳块。空肠黏膜可见肠绒毛 萎缩，哺乳仔猪肠系膜淋巴管的乳糜管消失。 组织学变化主要以空肠为主，从胃至直肠呈厂范围的渗出性卡他性炎症变化。其特征是肠绒毛萎 缩变短，回肠变化稍轻微。小肠变化有较明显的年龄特征，新生猪变化严重。电子显微镜观察，可见小 肠上皮细胞的微绒毛、线粒体、内质网以及其他细胞质内的成分变性。在细胞质空泡内有病毒粒子存 在。 6实验室诊断 6.1仪器、材料与试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的灭菌双蒸水或超纯 水。 倒置显微镜、冷冻离心机、微孔滤膜、滤器、细胞培养瓶、盖玻片、温箱、荧光显微镜、冷冻切片机、载 玻片、滴管、定量加液器、微量吸液器及配套吸头、96孔或40孔聚乙烯微量反应板、单通道、8通道微量 吸液器及配套吸头、二氧化碳培养箱、微量振荡器及小培养瓶、酶标检测仪等。仔猪肾原代细胞或 PK15、ST细胞系。荧光抗体（FA），猪抗TGE-IgG及猪抗TGE-IgG-HRP,病毒抗原和标准阴性血 清、阳性血清，抗原和酶标抗体。磷酸盐缓冲液（PBS）、细胞培养液、病毒培养液、HEPES液、0.1%伊文 斯蓝原液、磷酸盐缓冲甘油、吸液、包被稀释液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物溶液、终止液（配制方 法见附录A)。 6.2病毒分离鉴定 6.2.1病料处理 将采集的小段空肠剪碎及肠内容物或粪便用含10000IU/mL青霉素、10000μg/mL链霉素的磷 酸盐缓冲液（PBS)（见A.1)制成5倍悬液，在4℃条件下3000r/min离心30min，取上清液，经0.22μm 微孔滤膜过滤，分装，一20℃保存备用。 6.2.2接种及观察 将过滤液（病毒培养液的10%）接种细胞单层上，37℃吸附1h后补加病毒培养液，逐日观察细胞病 变（CPE），连续3d～4d，按CPE变化情况可盲传2代～3代。 6.2.3病毒鉴定 CPE变化的特点：细胞颗粒增多，圆缩，呈小堆状或葡萄串样均匀分布，细胞破损，脱落。对不同细 胞培养物，CPE可能有些差异。分离病毒用细胞瓶中加盖玻片培养，收毒时取出盖玻片（包括接毒与不 接毒对照片）用直接荧光法做鉴定。鉴定方法和结果判定见6.3。 6.3直接免疫荧光法 2 NY/T548—2015 6.3.1样品 组织样本：从急性病例采取空肠（中段）或肠系膜淋巴结。 6.3.2操作方法 6.3.2.1标本片的制备 将组织样本制成4μm～7μm冰冻切片。或将组织样本制成涂片：肠系膜淋巴结用横断面涂抹片； 空肠则刮取黏膜面做压片。标本片制好后，风干。于丙酮中固定15min。再置于PBS中浸泡10min~ 15 min,风于。 细胞培养盖玻片：将分离毒细胞培养24h～48h的盖玻片及阳性、阴性对照片在PBS中冲洗3次， 风干。于丙酮中固定15min，再置于PBS中浸泡10min15min，风干。 6.3.2.2染色 用0.02%伊文思蓝溶液（见A.5）将FA稀释至工作浓度（1：8以上合格）。4000r/min离心 10min，取上清液滴于标本上，37℃恒温恒湿染色30min，取出后用PBS冲洗3次，依次为3min、4min 和5min，风干。 6.3.2.3封固 滴加磷酸盐缓冲甘油（见A.6），用盖玻片封固。尽快做荧光显微镜检查。如当日检查不完则将荧 光片置于4℃冰箱中，不超过48h内检查。 6.3.3结果判定 被检标本的细胞结构应完整清晰，并在阳性、阴性对照均成立时判定。细胞核暗黑色、胞浆呈苹果 绿色判为阳性；所有细胞浆中无特异性荧光判定为阴性。 按荧光强度划为4级： a）十十++：胞浆内可见闪亮苹果绿色荧光； b）十十十：胞浆内为明亮的苹果绿色荧光； c）十+：胞浆内呈一般苹果绿色荧光； d）十：胞浆内可见微弱荧光，但清晰可见。 凡出现a)～d)不同强度荧光者均判定为阳性。当无特异性荧光，细胞浆被伊文斯蓝染成红色，胞 核黑红色者判为阴性。 6.4双抗体夹心ELISA 6.4.1材料准备 6.4.1.1洗液、包被稀释液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物溶液、终止液配制方法见附录A。 6.4.1.2待检样品：取发病仔猪粪便或仔猪肠内容物，用浓盐水1：5稀释，3000r/min离心20min， 取上清液，分装，一20℃保存备用。 6.4.2操作方法 6.4.2.1冲洗包被板 向各孔注人洗液（见A.7），浸泡3min，甩干，再注人洗液，重复3次。甩去孔内残液，在滤纸上吸 干。 6.4.2.2包被抗体 用包被稀释液（见A.8）稀释猪抗TGE-IgG至使用倍数，每孔加100μL，置于4℃过夜，弃液，冲洗 同6.4.2.1。 6.4.2.3加样品 性抗原、阳性抗原及稀释液对照各两孔，置于37℃作用2h，弃样品，冲液，冲洗同6.4.2.1。 3 NY/T548—2015 6.4.2.4加酶标记抗体 每孔加100uL经酶标抗体稀释液（见A.10)稀释至使用浓度的猪抗TGE-IgG-HRP，置于37℃ 2h，冲洗同6.4.2.1。 6.4.2.5加底物溶液 每孔加新配制的底物溶液（见A.11)100μL，置于37℃30min。 6.4.2.6终止反应 每孔加终止液