ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 546—2015 代替NY/T546—2002 猪传染性萎缩性鼻炎诊断技术 Detection of infectious atrophic rhinitis for swine 行业标准信息服务平台 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部 3发布 NY/T546—2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T546—2002《猪传染性萎缩性鼻炎诊断技术》。 本标准与NY/T546一2002相比，病原部分增加了病原菌的PCR诊断方法。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 本标准主要起草人：彭发泉、杨旭夫、苑士祥、王春来。 本标准的历次版本发布情况为： NY/T546—2002。 行业标准信息服务平台 I NY/T546—2015 猪传染性萎缩性鼻炎诊断技术 1范围 本标准规定了猪传染性萎缩性鼻炎的诊断标准及技术方法。 本标准适用于猪传染性萎缩性鼻炎的诊断和检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 支气管败血波氏杆菌bordetellabronchiseptica 波代杆菌属。 3. 2 产毒素性多杀巴氏杆菌toxigenicpasteurellamultocida 巴氏杆菌属。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AR：atrophic rhinitis菱缩性鼻炎。 DNA：deoxyribonucleic acid脱氧核糖核酸。 NLHMA：新霉素洁霉素血液马丁琼脂。 HFMA：血红素呋喃唑酮改良麦康凯琼脂。 PBS:phosphatebuffersolution磷酸盐缓冲液。 息服务平 PCR：polymerasechainreaction聚合酶链式反应。 Taq 酶:taq DNA polymerase Taq DNA聚合酶。 5临床诊断 5.1流行特点 猪传染性萎缩性鼻炎是由于仔猪生后早期在鼻腔感染支气管败血波氏杆菌I相菌或其后重复感染 产毒素性多杀巴氏杆菌（主要为荚膜D型，也有荚膜A型）引起的。这两种致病菌均产生细胞内皮肤坏 死毒素，在感染过程中释放，穿透被破坏的鼻黏膜屏障，作用于生长迅速的仔猪鼻甲骨及鼻中隔骨组织， 引起骨吸收、骨坏死及骨再造障碍变化，并可引起全身骨骼钙代谢障碍和淋巴免疫系统抑制。致病力不 同的菌株产生毒素的能力也不同；毒素的致病作用具有明显的年龄和剂量依赖性。病菌通常通过病猪 和带菌猪的鼻汁，经直接或间接接触而传播。支气管败血波氏杆菌越在生后早龄感染，病变越重。1月 1 NY/T546—2015 龄以后感染时，多为中等或轻症病例，且鼻甲骨容易再生修复；2月龄～3月龄时感染，仅呈组织学的轻 症经过，不引起肉眼的鼻甲骨萎缩病变。支气管败血波氏杆菌引起的鼻甲骨萎缩，只在少数严重病例伴 有鼻部变形变化。多杀巴氏杆菌的鼻腔感染在猪的日龄上晚于支气管败血波氏杆菌。产毒素性多杀巴 氏杆菌菌株尽管在实验室人工感染证明在辅助刺激下可单独引起猪的萎缩性鼻炎，但至今在疫群仍发 现是支气管败血波氏杆菌I相菌的重复或继发感染病原菌。产毒素性多杀巴氏杆菌菌株与支气管败血 波氏杆菌I相菌菌株重复或继发感染，可在更年长的仔猪引起不可逆的持续的鼻甲骨萎缩病变[即所谓 “进行性萎缩性鼻炎”（progressiveatrophicrhinitis)，在疫群中产生较多的鼻部变形病猪，尤以早龄感 染两种菌的强毒力株时为严重。饲养管理和环境应激因素及其他继发病原，均可影响仔猪的发病程度。 5.2临床症状 5.2.1仔猪群 有一定数目的仔猪流鼻汁、流泪、经常喷嚏、鼻塞或咳嗽，但无热，个别鼻汁混有血液。一些仔猪发 育迟滞，犬齿部位的上唇侧方肿胀。 5.2.2育成猪群和成猪群 a) 鼻塞，不能长时间将鼻端留在粉料中采食；頔血，饲槽沿染有血液。 两侧内眼角下方颊部形成泪斑”。 C） 鼻部和颜面变形： 1）上颚短缩，前齿咬合不齐（评定标准：下中切齿在上中切齿之后为阴性，反之为阳性）； 2） 鼻端向一侧弯曲或鼻部向一侧歪斜； 3） 鼻背部横皱褶逐渐增加； 4） 眼上缘水平上的鼻梁变平变宽。 d）伴有生长欠佳。 5.2.3检疫对象猪群 发现有上述征候群，可以临床上初步诊断猪群有支气管败血波氏杆菌I相菌的传染或与产毒素性 多杀巴氏杆菌的混合感染，特别是5.2.2中c)具有本病临床指征意义，需进行检菌、血清学试验及病理 解剖检查，予以确诊。 5.3病理变化 5.3.1尸体外观检查 主要检查有无鼻部和颜面变形及发育迟顿，记录其状态和程度。对上颚短缩可以做定性，下中切齿 在上中切齿之后判为”，反之判定为”十”；测量上中切齿与下中切齿的离开程度，如一3mm或十12 mm分别判定为正常或阳性。 5.3.2鼻部横断检查 5.3.2.1查鼻腔是在鼻部做1个～3个横断，检查横断面。鼻部的标准横断水平在上颚第二前白齿的 前缘（此部鼻甲骨卷曲发育最充分）。先除去术部皮肉，然后用锐利的细齿手锯或钢锯以垂直方向横断 鼻部。可再向前（通过上颚犬齿）或向后做第二和第三新的横断，其距离大猪为1.5cm～2cm，哺乳仔猪 约0.5 cm。 5.3.2.2为便于检查断面，先用脱脂棉轻轻除去锯屑。如果拍照，应将鼻道内的凝血块等填物除去，使 断面构造清晰完整。必要时，可用吸水纸吸除液体。 5.3.2.3检查鼻道内分泌物的性状和数量及黏膜的变化（水肿、发炎、出血、腐烂等）。 5.3.2.4主要检查鼻甲骨、鼻中隔和鼻腔周围骨的对称性、完整性、形态和质地（变形、骨质软化或疏 松、萎缩以至消失）以及两侧鼻腔的容积。如果需要，可以测量鼻中隔的倾斜或弯曲程度、鼻腔纵径及两 侧鼻腔的最大横径。除肉眼检查外，应对鼻甲骨进行触诊，以确定卷曲及其基础部骨板的质地（正常骨 板坚硬，萎缩者软化以至消失）。鼻甲骨萎缩主要发生于下鼻甲骨，特别是腹卷曲。鼻腔标准横断面的 2 NY/T546—2015 萎缩性鼻炎分级标准见附录A。 5.3.3肺部检查 少数病仔猪伴有波氏杆菌性支气管肺炎。肺炎区主要散在于肺前叶及后叶的腹面部分，特别是肺 门部附近，也可能散在于肺的背面部分。病变呈斑块状或条状发生。急性死亡病例均为红色肺炎灶。 5.3.4具有鼻甲骨萎缩病变的病猪 不论有或无临床鼻部弯曲等颜面变形症状，判定为萎缩性鼻炎病猪。 6实验室诊断 6.1仪器、材料与试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的灭菌双蒸水或超纯水。 6.1.1试剂 蛋白陈、琼脂粉、氯化钠、氯化钾、葡萄糖、乳糖、三号胆盐、中性红、呋喃唑酮二甲基甲酰胺、牛或绵 羊红细胞裂解液、马丁琼脂、脱纤牛血、硫酸新霉素、盐酸洁霉素、多型蛋白陈、牛肉膏、磷酸二氢钾、磷酸 氢二钠、硫代硫酸钠、硫酸亚铁铵、混合指示剂、尿素、酸性品红、马铃薯、甘油、盐酸、dNTPs、Taq酶。 6.1.2材料 无菌棉拭子、无菌1.5mL离心管、无菌试管、PCR管、一次性培养血。 6.2病原分离 由猪鼻腔采取鼻黏液，同时进行支气管败血波氏杆菌I相菌及产毒素性多杀巴氏杆菌的分离。猪 群检疫以4周龄～16周龄特别是4周龄～8周龄猪的检菌率最高。 6.2.1鼻黏液的采取 6.2.1.1由两侧鼻腔采取鼻黏液，可用一根棉头拭子同时采取两侧鼻黏液，或每侧鼻黏液分别用一根 棉头拭子采取。 6.2.1.2子的长度和粗细视猪的大小而定，应光滑可弯曲，由竹皮等材料削成，前部钝圆，缠包脱脂 棉，装人容器，高压灭菌。 6.2.1.3小猪可仰卧保定，大猪用鼻子保定。用拧去多余酒精的酒精棉先将鼻孔内缘清拭，然后清 拭鼻孔周围。 6.2.1.4拭子插人鼻孔后，先通过前庭弯曲部，然后直达鼻道中部，旋转拭子将鼻分泌物取出。将拭子 插入灭菌空试管中（不要贴壁推进），用试管棉塞将拭子杆上端固定。 6.2.1.5夏天不能立即涂抹培养基时，应将拭子试管立即放入冰箱或冰瓶内。鼻黏液应在当天最好在 几小时内涂抹培养基，拭子仍保存于4℃冰箱备复检。 6.2.1.6采取鼻汁时病猪往往喷嚏，术者应注意消毒手，防止材料交叉污染。 6.2.1.7解剖猪时，应采取鼻腔后部（至筛板前壁）和气管的分泌物及肺组织进行培养。鼻锯开术部及 鼻锯应火焰消毒，由鼻断端插入拭子直达筛板，采取两侧鼻腔后部的分泌物。气管由声门插人拭子达气 管下部，在气管壁旋转拭子取出气管上下部的分泌物。肺在肺门部采取肺组织，如有肺炎并在病变部采 取组织块；也可以用拭子插人肺断面采取肺汁和碎组织。 6.2.2分离培养 所有病料都直接涂抹在已干燥的分离平板上。分离支气管败血波氏杆菌使用血红素喃唑酮改良 麦康凯琼脂（HFMA）平板（配方见附录B），分离多杀巴氏杆菌使用新霉素洁霉素血液马丁琼脂（NLH MA)平板（配方见附录C）。棉拭子应尽量将全部分泌物浓厚涂抹于平板表面，组织块则将各断面同样 浓厚涂抹。重要的检疫，如种猪检疫对每份鼻腔病料应涂抹每种分离平板2个。不同种分离平板不能 混涂同一拭子（因抑菌剂不同）。对伴有肠道感染（腹泻）的或环境严重污染的猪群，每份鼻腔病料可用 3 NY/T546—2015 一