ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 544—2015 代替NY/T544—2002 猪流行性腹泻诊断技术 Diagnostic techniques for porcine epidemic diarrhea 行业标准信息服务平台 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 544—2015 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T544—2002《猪流行性腹泻诊断技术》。 本标准与NY/T544—2002相比，病原检测部分增加了RT-PCR检测方法。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 本标准主要起草人：冯力、陈建飞、时洪艳、张鑫。 本标准的历次版本发布情况为： -NY/T544—2002。 行业标准信息服务平台 I NY/T 544—2015 猪流行性腹泻诊断技术 1 范围 本标准规定了猪流行性腹泻的病原学检测和血清学检测。病原学检测包括病毒分离与鉴定、直接 免疫荧光法、双抗体夹心酶联免疫吸附试验和反转录一聚合酶链式反应。血清学检测包括血清中和试 验和间接酶联免疫吸附试验。 本标准适用于对猪流行性腹泻的诊断、产地检疫及流行病学调查等。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 猪流行性腹泻porcineepidemicdiarrhea，PED 猪流行性腹泻是由尼多目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、α-冠状病毒属的猪流行性 腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheauirus，PEDV)引起的猪的-一种高度接触传染性的肠道疾病，以呕 吐、腹泻、脱水和哺育仔猪高死亡率为主要特征。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE：cytopathiceffect细胞病变作用。 DIA：direct immunofluorescence assay直接免疫荧光法。 ELISA：enzyme-linked immunosorbentassay酶联免疫吸附试验。 PBS:phosphatebuffered saline磷酸盐缓冲液。 PED:porcineepidemic diarrhea猪流行性腹泻。 PEDV:porcine epidemic diarrheavirus猪流行性腹泻病毒。 RT-PCR：teversetranscription-polymerasechainreaction反转录聚合酶链式反应 5临床诊断 5.1流行特点 本病一年四季均可发生，主要发生在每年的12月到翌年的3月，有时也发生于夏季、秋季。各种年 龄的猪均可感染，尤其是1周龄内的哺乳仔猪，发病率和死亡率可高达100%。病猪、带毒猪和隐性感 染猪是本病的主要传染源。病毒通过粪一口途径或感染母猪的乳汁进行传播。 5. 2临床症状 病猪首先表现为呕吐，多发生在乳或吃食后，吐出的胃内容物呈黄色或乳白色。随后出现水样腹 1 NY/T5442015 泻，腹泻物呈灰黄色、灰色，或呈透明水样，顺肛门流出，沾污臀部。表现脱水、眼窝下陷，行走，精神 沉郁，食欲减退或停食。症状与年龄大小有关，年龄越小症状越重。1周龄以内的仔猪在发生腹泻3d～ 4d后，常因严重脱水而死亡。断乳猪、育肥猪以及母猪症状较哺乳仔猪轻，表现精神不振、厌食，持续腹 泻4d～7d后逐渐恢复正常，少数猪生长发育不良。成年猪表现为厌食和腹泻，个别表现为呕吐。 5.3病理变化 肉眼可见的病理变化只限于小肠，可见小肠膨胀，肠壁变薄，外观明亮，肠管内有黄色或灰色液体或 带有气体。肠系膜充血及肠系膜淋巴结肿大。组织学检查可见，小肠绒毛细胞的空泡形成和脱落，肠绒 毛萎缩、变短，绒毛高度与隐窝深度从正常的7：1降低为3：1。超微结构的变化，主要发生在肠细胞 的胞浆，可见细胞器的减少，产生电子半透明区，微绒毛终末网消失。细胞变得扁平。细胞脱落，进人肠 腔。在结肠也可见到细胞变化，但未见到脱落。 6实验室诊断 6.1病毒分离与鉴定 6.1.1仪器、材料与试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的灭菌双蒸水或超纯水。 倒置显微镜、冷冻离心机、微孔滤器、细胞培养瓶、盖玻片、温箱等。Vero细胞系、仔猪空肠内容物 及小肠内容物或粪便。磷酸盐缓冲液（PBS)、细胞培养液、病毒培养液、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷 磺酸（HEPES)液（配制方法见附录A）。 6. 1.2病毒分离 将采集的小段空肠连同肠内容物或粪便用含1000IU/mL青霉素、1000μg/mL链霉素的PBS制 用或置一20℃保存备用。将过滤液（病毒培养液的10%接种于Vero细胞单层上，同时加过滤液量 50%的病毒培养液，37℃吸附1h。根据组织培养瓶大小添加病毒培养液至病毒培养总量，置37℃培 养，逐日观察3d～4d，按致细胞病变作用（CPE）变化情况，可盲传2代～3代。 6.1.3结果判定 CPE变化的特点是细胞面粗糙、颗粒增多，有多核细胞（7个～8个甚至几十个），并可见空斑样小 区，细胞逐渐脱落。这是特征性的CPE，可与猪传染性胃肠炎（TGE)病毒的CPE相区别。同时，在细胞 培养瓶中加盖玻片，收毒后用直接荧光做鉴定试验。有条件时可进行电镜观察，用负染法在阳性样品中 6.2直接免疫荧光法 6.2.1仪器、材料与试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的灭菌双蒸水或超纯水。 荧光显微镜、冷冻切片机、载玻片、盖玻片、温箱、滴管等。荧光抗体（FA）、急性期内（5d～7d）患猪 空肠中段的黏膜上皮或肠段。磷酸盐缓冲液（PBS）、0.1%伊文思蓝原液、磷酸盐缓冲甘油（配制方法见 附录 B)。 6.2.2标本片的制备 6.2.2.1组织标本 定10min，置于PBS中浸泡10min~15min，风干或自然干燥。 6.2.2.2细胞培养盖玻片 将分离毒细胞培养24h～48h的盖玻片及阳性、阴性对照片在PBS中冲洗数次，放入丙酮中固定 10min，再置于PBS中浸泡10min~15min，风于。 2 NY/T544—2015 6.2.3FA染色 用0.02%伊文思蓝原液将FA稀释至工作浓度（1：8以上合格）。4000r/min离心10min，取上清 液滴于标本上。37℃恒温恒湿染色30min，用PBS冲洗3次，依次为3min、4min、5min，风干，滴加磷 酸盐缓冲甘油，盖玻片封固，荧光显微镜检查。 6.2.4结果判定 判定标准：在荧光显微镜下检查，被检标本的细胞结构应完整清晰，并在阳性、阴性对照均成立时判 定。在胞浆中见到特异性苹果绿色荧光判定为阳性，如所有细胞浆中无特异性荧光判定为阴性。 可根据细胞内荧光亮度强、弱分别做如下记录： a）十+十十：呈闪亮苹果绿色荧光； b）+十十：呈明亮苹果绿色荧光； c）十十：呈一般苹果绿色荧光； d）十：呈较弱绿色荧光； e）一：呈红色。 结果为a)～d)者均判为阳性。 6.3双抗体夹心ELISA 6.3.1仪器、材料与试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的灭菌双蒸水或超纯水。 定量加液器、微量移液器及配套吸头、96孔或40孔聚乙烯微量反应板、酶标测试仪。猪抗PED- IgG、猪抗PED-IgG-HRP（HRP为辣根过氧化物酶）、发病仔猪粪便或肠内容物。洗液、包被稀释液、 样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物溶液、终止液（配制方法见附录C）。 6.3.2操作方法 将发病仔猪粪便或肠内容物用浓盐水1：5稀释，3000r/min离心20min，取上清液待检。 6.3.2.1冲洗包被板 向各孔注人无离子水，浸泡3min甩干，重复3次，甩于孔内残液，在滤纸上吸干。 6.3.2.2包被抗体 用包被稀释液稀释猪抗PED-IgG至使用倍数，每孔加100μL，置于4℃过夜，弃液，用洗液冲洗3 次，每次3min。 6.3.2.3加样品 原、阳性抗原及稀释液对照各两孔。置于37℃作用2h，弃样品，冲洗同6.3.2.2。 6.3.2.4加酶标记抗体 新服务平台 每孔加100μL经酶标抗体稀释液稀释至使用浓度的猪抗PED-IgG-HRP，置于37℃2h，弃液， 冲洗同6.3.2.2。 6.3.2.5加底物溶液 每孔加新配置的底物溶液100μL，置于37℃30min。 6.3.2.6终止反应 每孔加终止液50μL，置于室温15min。 6.3.3结果判定 用酶标测试仪在波长492nm下测定吸光度（OD)值。阳性抗原对照两孔平均OD值>0.8，阴性抗 原对照两孔平均OD值≤0.2为正常反应。按以下两个条件判定结果：P/N值≥2，且被检抗原两孔平 均OD值≥0.2判为阳性，否则为阴性。 注：P为阳性孔的OD值，N为阴性对照孔的OD值。 3 NY/T 544—2015 6.4 RT-PCR 6.4.1仪器、材料与试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的灭菌双蒸水或超纯水。 PCR扩增仪、1.5mL离心管、0.2mLPCR反应管、电热恒温水槽、台