ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 538—2015 代替NY/T538-—2002 鸡传染性鼻炎诊断技术 Diagnostic techniques for infectious coryza of chickens 行业标准信息服务平台 2015-10-09发布 2015-12-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T538—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准提供了几种诊断鸡传染性鼻炎的方法以及抗体检测方法，应根据使用单位的具体情况选择 使用。 本标准代替NY/T538-2002《鸡传染性鼻炎诊断技术》。与NY/T538—2002相比，除编辑性修 改外主要技术变化如下： 删除了琼脂双向双扩散试验和阻断酶联免疫吸附试验（B-ELISA)两种方法（见2002年版的6 和8)； 增加了临床诊断（见2）； -增加了血凝抑制试验（鉴定副鸡禽杆菌的血清型）（见5）； 增加了B型副鸡禽杆菌的血凝抑制抗体的检测（见7.2.1）。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：北京市农林科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：孙惠玲、陈小玲、张培君、苗得园。 本标准的历次版本发布情况为： -NY/T 538--2002。 行业标准信息服务平台 1 NY/T538—2015 引言 鸡传染性鼻炎是由副鸡禽杆菌（Avibacteriumparagallinarum，Aparagallinarum）引起的一种鸡 急性上呼吸道传染病。本病在世界许多地方都有发生和流行，引起蛋鸡产蛋量下降，育成鸡生长发育受 阻和淘汰率增加，肉鸡肉质下降，造成很大的经济损失。 Page分型方法将副鸡禽杆菌分为A、B、C3种血清型，我国从1980年起就有许多疑似本病的病例 出现。到目前为止，3种血清型引起的发病都有报道，它们具有共同抗原和各自的型特异性抗原，可以 通过检测型特异性抗原来鉴定副鸡禽杆菌的血清型。另外，鸡传染性鼻炎商品化灭活疫苗的免疫接种 十分广泛，应用血清学试验可以检出各型特异性抗体，用来评价疫苗的免疫效果。 近10年来，我国的鸡传染性鼻炎疫情又有了新的变化，主要表现在两个方面：一是目前我国鸡传染 的流行。二是原有标准在抗体的检测上提供了几种方法，但是在鉴定抗原方面提供的方法很局限，基本 上没有提供能够鉴定血清型的诊断方法。为了适应我国标准化工作发展的需要，为鸡传染性鼻炎的诊 断和防控提供技术依据和保障，有必要对NY/T538一2002进行修订。 行业标准信息服务平台 Ⅱ NY/T538—2015 鸡传染性鼻炎诊断技术 1范围 本标准规定了引起鸡传染性鼻炎的副鸡禽杆菌的诊断技术要求。 本标准中规定的临床诊断、细菌分离鉴定、聚合酶链式反应（PCR)技术适用于鸡传染性鼻炎的诊断，血 凝抑制试验（鉴定副鸡禽杆菌的血清型适用于鉴定菌株的血清型。血清平板凝集试验、血凝抑制试验（检 测副鸡禽杆菌抗体）、间接酶联免疫吸附（ELISA)试验适用于流行病学调查和免疫鸡群抗体的检测。 2临床诊断 鸡传染性鼻炎的一个特征是潜伏期短、发病迅速。最明显的症状是鼻腔有黏液性分泌物流出、面部 水肿、结膜炎以及泪液分泌增多。公鸡有时可见肉垂肿胀。病鸡可出现腹泻、采食和饮水下降，蛋鸡产 蛋下降。发病率高但死亡率低，死亡率可因其他病原继发感染或者混合感染而升高。 如果症状全部符合或者有部分符合，则可判为可疑，再进行如下的细菌分离鉴定。 3细菌的分离鉴定 3.1材料准备 3.1.1无菌棉拭子、鲜血琼脂平板培养基、无菌鸡血清或牛血清、TSA（胰蛋白陈大豆琼脂，Tryptic So yaAgar）和TSB（胰蛋白陈大豆肉汤，TrypticSoyaBroth)培养基。 3.1.2产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD,或还原型NAD)表皮葡萄球菌。 3.2操作程序 3.2.1无菌打开可疑鸡的眶下窦，用灭菌棉拭子蘸取其中黏液或浆液。 3.2.2用棉拭子在鲜血琼脂平板培养基上横向划线5条～7条，然后用接种环取表皮葡萄球菌从横线 中间划一纵线。 3.2.3将划好的平血置于5%的COz培养箱中(37±1)℃培养24h～40h。 3.2.4观察菌落特点。 3.2.5取菌落做过氧化氢酶试验，必要时通过进一步的生化反应做详细的特征鉴定。副鸡禽杆菌的生 化反应特点、培养特性及过氧化氢酶试验方法见附录A。 3.2.6应用PCR方法鉴定可疑菌落，经PCR鉴定正确后，取可疑菌落纯培养物作为攻毒样品进行动 物试验，方法见附录B。 3.3结果判定与表示方法 若鲜血琼脂培养基上出现“卫星样”生长的露珠状、针尖大小的小菌落，即靠近产NAD表皮葡萄球菌 处菌落较大，直径可达0.3mm，离产NAD表皮葡萄球菌菌落越远，菌落越小，过氧化氢酶阴性，结果判为 阳性，记为“十”；若无卫星现象，但有露珠状、针头大小的小菌落且过氧化氢酶阴性，则需要采用进一步 PCR或者动物试验鉴定，以避免漏检不需要NAD的副鸡禽杆菌。若无上述现象，则判为阴性，记为“二”。 4聚合酶链式反应（PCR）技术 4.1材料准备 4.1.1试验材料 生理盐水、去离子水、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、GoldviewDNA染料。阴性对照为灭菌去离子水、 1 NY/T538—2015 阳性对照为副鸡禽杆菌菌株。 4.1.2仪器及耗材 PCR仪、微量加样器、小型高速离心机、电泳仪、水平电泳槽、紫外检测仪；1.5mL及0.2mL小离 心管、吸头。 4.2操作程序 4.2.1PCR临床样品的采集 无菌打开可疑病鸡的眶下窦，用灭菌棉拭子蘸取其中黏液或者浆液，浸人含0.8mL1.0mL生理 盐水的1.5mL离心管内，室温放置0.5h后，将棉拭子在管壁上尽量挤干，然后弃至消毒液缸中。 4.2.2PCR临床样品的处理 将浸过棉拭子的离心管以6000×g离心10min，小心弃去大部分上清液，保留20μL左右液体（若 样品中混有血液，可800×g离心5min，将红细胞沉淀至管底部，将上清液转至新管中，再6000Xg离 心10min）。然后加人20μL灭菌去离子水，压紧管盖，煮沸10min，再冰浴10min，6000×g离心2 min，取出上清作为PCR样品，或者保存于一20℃。 4.2.3PCR菌落样品的制备 挑取平血上的可疑菌落，加到含20μL灭菌去离子水的PCR离心管中，压紧管盖，煮沸10min，再 冰浴10min后离心取上清作为PCR样品，或者保存于一20℃。 4.2.4引物 上游引物:5'-TgA ggg TAg TCT TgC ACg CgA AT -3'; 下游引物:5'-CAA ggT ATC gAT CgT CTC TCT ACT -3'。 4.2.5PCR扩增 反应体系:2Xbuffer12.5μL,Taq(5U/μL)0.5 μL,dNTP(2.5mmol/L)2μL,N1(10 μmol/L)0.5 μL，R1（10μmol/L)0.5μL，样品4μL，灭菌去离子水5μL，总体积为25μL。PCR反应程序：第一阶段， 94℃5min；第二阶段，94℃45s，56℃45s，72℃1min，30个循环；第三阶段，72℃延伸10min。 反应结束后1%琼脂糖凝胶检测，在凝胶成像系统上观察是否有目的条带出现。也可使用商品化 的PCR混合试剂，按说明书操作，只需在PCR试剂中加人引物和被检样品。 4.3结果判定 阳性对照样品出现一条0.5kb的DNA条带，若阴性对照样品无此条带，被检样品出现与阳性对照 同样大小的条带，则判为阳性。否则为阴性。如果阴、阳性对照结果不成立，则全部样品应该重做。结 果判定参见附录C。 5血凝抑制试验(鉴定副鸡禽杆菌的血清型) 5.1材料准备 5.1.1副鸡禽杆菌标准A型、B型、C型分型血清及血凝抑制试验A型、B型、C型标准抗原。 5.1.2KSCN/NaCI溶液，PBS和PBSS稀释液，制备方法见附录D。 5.1.3新鲜红细胞悬液及醛化红细胞(GA-RBC)悬液，制备方法见附录E。 5.1.496孔微量血凝板（V型）、微量振荡器、微量加样器及吸头。 5.2操作程序 5.2.1被检抗原制备 持续搅拌2h，再8000×g离心10min，其沉淀用PBS离心洗涤3次，然后用5mLPBS悬浮，冰浴中超 2 NY/T538—2015 声波300W裂解5s，间隔5s，共裂解15min，再8000×g离心10min，其沉淀用2mLPBS（含有0.01% 硫柳汞)悬浮，即为血凝抑制试验所需抗原。用于血凝试验、血凝抑制试验或者一20℃保存备用。 5.2.2本操作最好在室温20℃～25℃范围内进行，如室温不在此范围内也可以置于37℃温箱中。注 意加盖盖子或者封口膜以防止液体蒸发。同时用A型、B型、C型分型血清对被检抗原进行以下操作， 以全面检出各型菌的感染。 5.2.3取洁净血凝板，将抗原用PBSS从2倍开始做2倍梯度稀释加人1列～11列孔中（即第1列孔 为1：2,第2列孔为1：4，依次类推至第11列孔），每孔最终液体量为25μL，第12列孔只加25μL PBSS作为醛化红细胞对照孔。 5.2.4每孔再加25μLPBSS。 5.2.5每孔加PBSS配置的1%醛化红细胞悬液25uL。 5.2.6充分振荡混合后，在室温（20℃~25℃）静置40min~60min或者37℃静置40min，至对照孔 （第12孔）红细胞完全下沉为准。 5.2.7判定抗原的血凝价（HA效价），即为使红细胞发生完全凝集的抗原最大稀释倍数。检测步骤及 抗原的检测结果如表1所示（表中，用“