ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T576—2015 代替NY/T576—2002 绵羊痘和山羊痘诊断技术 Clinical diagnostic technology for sheep pox and goat pox 行业标准信息服务平台 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 576—2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T576—2002《绵羊痘和山羊痘诊断技术》。 本标准与NY/T576—2002相比，病原检测部分增加了PCR检测方法。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国兽医药品监察所。 本标准主要起草人：支海兵、薛青红、印春生、李宁、王乐元、江焕贤。 本标准的历次版本发布情况为： -NY/T576—2002。 行业标准信息服务平台 I NY/T576—2015 绵羊痘和山羊痘诊断技术 1范围 本标准规定了绵羊痘和山羊痘（以下简称羊痘）的诊断方法。 本标准所规定的临床检查和PCR试验适用于羊痘的诊断以及产地、市场、口岸的现场检疫；中和试 验和PCR试验适用于羊痘的诊断、检疫和流行病学调查；电镜检查、包涵体检查适用于羊痘病原的检 测。 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE：cytopathiceffect致细胞病变作用。 H.E：hematoxylin-eosinstaining苏木精一伊红染色。 MEM:minimunessentialmedium低限基础培养基。 PCR:polymerase chain reaction聚合酶链反应。 Tris-EDTA:tris-ethylene diamine tetraacetic acid 1三羟甲基氨基甲烷一乙二胺四乙酸。 3临床检查 3.1临床症状 羊痘的潜伏期一般为5d14d，感染初期表现为发热，体温超过40℃，精神、食欲渐差。经2d～5d 后开始出现斑点，先在体表无毛或少毛皮肤、可视黏膜上出现明显的小充血斑，随后在全身或腹股沟、腋 下、会阴部出现散在或密集的痘疹，进而形成痘肿，分典型痘肿和非典型痘肿。 a）典型痘肿：初期时，痘肿呈圆形，皮肤隆起，微红色，边缘整齐；进而发展为皮下湿润、水肿、水 泡、化脓、结痴等反应。同时，痘肿的质地由软变硬；皮肤颜色由微红逐渐变为深红、紫红，严重 的可成为“血痘”。患羊一般为全身发痘，并伴有全身性反应。 b）非典型痘肿：在痘肿的发生、发展和消退过程中，皮肤无明显红色，无严重水肿，未出现水泡、化 脓、结痴等反应，痘肿较小，质地较硬，有的成为“石痘”。患羊无严重的全身性反应。 随着病程的发展，有的病羊尚可见鼻炎、结膜炎、失明、体表淋巴结特别是肩前淋巴结肿大。病羊 喜卧不起、废食、呼吸困难，严重的体温急剧下降，随后死亡。 存活病羊，可在痘肿结痴后1个月～2个月，痴皮自然脱落，在皮肤上留下痘痕（疤）。 3.2病理变化 病羊痘肿皮肤的主要病理变化表现为一系列的炎性反应，包括呼吸器官和消化器官上有大小、数量 不等的痘斑、结节或溃疡；在肝脏、肾脏表面偶可见白斑；全身淋巴结肿大：细胞浸润、水肿、坏死和形成 毛细血管血栓。户体剖检，通常可见不同程度的黏膜坏死。 4实验室诊断技术 4.1样品采集 取活体或剖检羊的皮肤丘疹、肺部病变组织、淋巴结用于病毒分离和抗原检测；病料采集时间为临 床症状出现后1周之内。采集病毒血症期间的组织进行病理组织学检查，病料为病变及病变周围组织， 采集后迅速置于10倍体积的10%福尔马林溶液中。经颈静脉无菌采集血液，分离血清，置于一20℃保 存，用于血清学检测。 1 NY/T576—2015 4.2样品运输 福尔马林浸润的组织在运输时无特殊要求，用于病毒分离和抗原检测的样品应置于4℃或一20℃ 保存。如果样品在无冷藏条件下需要运送到较远的地方，应将样品置于含10%甘油的Hanks液中。用 于血清学检测的样品，应置于加冰的冷藏箱内运输。 4.3病原鉴定 4.3.1病毒分离 4.3.1.1材料 MEM培养液（配制方法见附录A）、待检组织绵羊羔睾丸细胞（制备方法见附录B)、胎牛血清细胞 培养瓶（25cm²）。 4.3.1.2方法 4.3.1.2.1样品制备 取待检组织，无菌剪碎，用组织匀浆器研磨；按1：10的比例加人MEM培养液制备组织悬液，4℃ 过夜；1500r/min离心10min，取上清备用。 4.3.1.2.2接种 取25cm²细胞培养瓶，待绵羊羔睾丸细胞形成90%单层后，接种1mL病料上清液，置37℃吸附1 h。弃去瓶内液体，补足细胞维持液，置37℃、5%COz条件下培养。同时，设立正常细胞对照1瓶。 4.3.1.2.3培养及观察 每日观察细胞培养物是否出现CPE，持续培养14d，在培养期间可适时更换MEM培养液。如果 14d仍未见CPE，将细胞培养物反复冻融3次，取上清液继续接种绵羊羔睾丸细胞，一旦出现CPE，可 进行包涵体染色检查。 4.3.1.3判定 羊痘病毒感染绵羊羔睾丸细胞的特征性CPE为细胞收缩变圆，界限明显，问隙变宽，形成拉网状， 细胞脱落，并形成嗜酸性包涵体。包涵体大小不等，最大的约为细胞核的一半。 4.3.2电镜负染检查法 4.3.2.1材料 待检组织载玻片、400目电镜甲碳网膜Tris-EDTA(pH7.8)缓冲液、1.0%磷钨酸(pH7.2)。 4.3.2.2方法 4.3.2.2.1样品制备 取待检组织，无菌剪碎，用组织匀浆器研磨，按1：5的比例加人MEM培养液制备组织悬液。 4. 3. 2.2.2制片 取一滴组织悬液置于载玻片上，将碳网膜漂浮于液滴上1min;将Tris-EDTA(pH7.8)缓冲液滴加 到碳网膜上浸泡20s；用滤纸吸干膜上液体，滴加1.0%磷钨酸（pH7.2)染色10s，用滤纸吸干膜上液 体，待其自然干燥后用透射电镜观察。 4.3.2.3病毒形态判定 在电镜下观察，病毒粒子呈卵圆形，大小为150nm～180nm。 4.3.3包涵体检查 4.3.3.1材料 组织病料（置于福尔马林溶液中或4℃保存备用）、载玻片、苏木精一伊红（H.E)染色液。 4.3.3.2方法 取组织病料，用切片机切成薄片置于载玻片上，或直接将病料在载玻片上制成压片（触片）。经H· E染色，置于光学显微镜下观察。 2 NY/T576—2015 4.3.3.3判定 羊痘病毒感染细胞的细胞质内应有不定形的嗜酸性包涵体，细胞核内应有空泡， 4.3.4中和试验 4.3.4.1材料 MEM培养液（配制方法见附录A）、绵羊羔睾丸细胞（制备方法见附录B）、羊痘抗原及阳性血清、待 检羊组织。 4.3.4.2方法 4.3.4.2.1样品制备 按4.3.1的方法将待检样品接种细胞，并培养至出现CPE时收获冻融后的细胞悬液，备用。 4.3.4.2.2抗原及阳性血清 阳性血清，恢复至室温备用。标定羊痘抗原滴度，并将抗原液用Hanks液进行系列稀释至100 TCIDso / 0. 1 mL. 4.3.4.2.3加样 取96孔细胞培养板，待检样品的细胞悬液、羊痘抗原（100TCIDso/0.1mL）各加2孔，每孔0.1 向孔内加人等量Hanks液，作为阳性血清对照；Hanks液加1孔，每孔0.2mL，作为空白对照。 4.3.4.2.4感作 将96孔细胞培养板摇匀后置于37℃水浴中和1h，期间每15min振摇1次。 4.3.4.2.5培养 取生长良好的绵羊羔罩丸细胞单层1瓶，按常规方法消化，调整细胞浓度至10°个/mL，每孔接种细 胞悬液0.1mL。接种后，置于37℃、5%CO2条件下培养。 4.3.4.2.6观察 培养4d～7d，每日观察CPE情况。 4.3.4.3结果判定 当正常细胞对照孔、羊痘抗原中和对照孔、阳性血清对照孔的细胞均无CPE，而羊痘抗原对照孔细 胞有特征性CPE，试验成立。待检样品中和试验孔细胞无CPE，而待检样品未中和试验孔的细胞有特 征性CPE，判定该待检抗原为羊痘抗原。 注：如果羊痘抗原中和对照细胞出现CPE,表明阳性血清不能完全中和100TCIDso/0.1mL的羊痘抗原，可对待检 样品和羊痘抗原进行适当稀释或更换更高效价的阳性血清再进行中和试验。 4.3.5 PCR试验 4.3.5.1材料 待检样品、羊痘病毒对照、DNA提取试剂盒、2XTaqMasterMix（商品化试剂）、1.5%琼脂糖凝胶 （见附录A）、1XTAE缓冲液（商品化试剂）、DNAMarkerI（商品化试剂）、上样缓冲液（商品化试剂）、 高压灭菌的去离子水、PCR仪、台式高速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、凝胶成像系统、微量移液 器、水浴锅、涡旋仪等。 4.3.5.2方法 4.3.5.2.1样品处理 取待检组织（皮肤或其他组织），无菌剪碎，用组织匀浆器研磨；按1：10的比例加入MEM培养液 制备组织悬液，4℃过夜；1500r/min离心10min，取上清备用；冻融的抗凝血、精液或培养上清液等液 体样品取0.2mL备用。 4.3.5.2.2DNA提取 在0.2mL血液样品中加人2uL蛋白酶K溶液（20mg/mL）或0.8mL组织样品中加入10L蛋 3 NY/T 576—2015 白酶K溶液。按DNA提取试剂盒说明书或以下方法提取DNA。将上述样品56℃孵育2h或过夜，再 100℃加热10h。按样品体积1：1的比例加人等体积的苯酚、氯仿和异戊醇溶液（体积比为25：24： 1）。振荡均匀，室温孵育10min。将样品4℃，16000g离心15min。小心收