ICS11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T572—2016 代替NY/T572—2002 免病毒性出血病血凝和血凝抑制试验方法 Haemagglutination and haemagglutination inhibition tests for rabbit haemorrhagicdisease 行业标准信息服务平台 2016-10-26发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T572—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T572—2002《兔出血病血凝和血凝抑制试验方法》。与NY/T572—2002相比， 除编辑性修改外，主要技术变化如下： 修改了微量血凝试验中V型微量滴定板中加人PBS的孔数（见6.1），修改了V型微量滴定板 第11孔的加人样品（见6.4）； 修改了玻片血凝法的取样方法和检测方法（见7）； 参考OIE《陆生手册》删除了微量血凝抑制试验检测免病毒性出血病病毒的方法（2002年版 2. 3); 增加了用于检测兔病毒性出血病病毒抗体的微量血凝抑制试验（见8）。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心。 本标准主要起草人：王芳、魏后军、宋艳华、范志宇、胡波、魏荣、孙映雪、徐为中。 本标准的历次版本发布情况为： NY/T572—2002。 行业标准信息服务平台 I NY/T572—2016 免病毒性出血病血凝和血凝抑制试验方法 1范围 本标准规定了免病毒性出血病病毒血凝和血凝抑制试验方法的技术要求。 本标准适用于免病毒性出血病病毒的鉴定和抗体检测。 2试剂 2.1 PBS(0.1 mol/L,pH 17.0 2.见 2.2阿氏液（Alseve s）见 3材料 3.1重组VP60抗原的制备 RESE 见附录B 3.2免病毒性出血病死 兔、待检免和健康免肝脏悬液的制备 分别将肝脏剪碎，按 10加人PBS后匀浆 青液备用。 3.3抗原工作液的制备 根据测定的重组 VP60抗原和/或免病毒性出血病死亡广免肝脏悬液的 CH 释成4个血凝单位的抗原工作液。 3.41%人"0"型红细胞悬液的制备 取新鲜人 O"型红 细胞于阿氏液中保存置2℃ 用时 型红细胞以20倍 量PBS混匀洗涤红细 最后 算红细胞悬液 体积（在离心后扣减究 上清液的体积，即为红细胞的体积）。洗涤质 配成1%悬液，置 的多 BS 2℃~8℃备用 3.5血清及其处理口 病毒性出血 3.5.2所有血清处理法：取 水浴灭活30min.加 “O"型红细胞（按照人 .56℃ “O"型红细胞与血清为1 110的比W 一8℃作用1h，以 g离心5min，收集上清 待检。 仪器设备 4.1离心机：要求最大离心力在12000×g 4. 2 温箱：（37土1)℃。 4.3恒温水浴锅。 4.42℃~8℃冰箱。 4.5微量移液器（0.5μL~10μL.2u~20μL，20μL~200μL，100μL~1000μL） 4. 6 微型振荡器。 5 微量血凝试验（用于检测免病毒性出血病病毒抗原） 5.1在96孔V型微量凝集板上，从第2孔至第10孔，每孔加入25uLPBS。 1 NY/T572—2016 5.2然后在第1孔、第2孔加人1：10的待检免肝悬液25μL。 5.3从第2孔开始，充分混合后用25μL移液器等量倍比稀释至第10孔，稀释后第10孔弃去25uL。 5.4第11孔～第12孔加1：10的健康免肝悬液为阴性对照。 待阴性对照孔中红细胞完全沉积后观察结果。 5.6每次测定应设已知效价的免病毒性出血病死亡免肝悬液阳性对照，方法同5.1~5.5。 5.7结果判定和红细胞凝集效价表示方法如下： b）“十十+”符号为75%以上凝集，有少于25%的红细胞沉积； c）“++符号为50%～75%凝集，有少于50%的红细胞沉积； e）“一”符号为100%的红细胞沉积。 免病毒性出血病死亡兔肝悬液阳性对照凝集效价与已知效价不得相差一个滴度以上，健康兔肝悬 液阴性对照无凝集；被检样品出现“++”的最高稀释度作为其凝集价，凝集价≥1：160（即第5孔）的 判为阳性，如在1：（20～80）之间，定为可疑，应重复试验，重复后仍为可疑的判为阳性。 6玻片血凝法（现场快速诊断，用于检测免病毒性出血病病毒抗原） 取少许待检免肝脏样品，置于清洁的载玻片上，用剪刀将肝脏样品剪碎，滴加2滴～3滴1%人“O” 型红细胞于肝脏样品上，同时设立免病毒性出血病阴、阳性肝脏对照，轻轻混匀后，于玻片上孵育2min， 若有免病毒性出血病病毒，肉眼可直接观察到玻片上出现血凝现象。 7微量血凝抑制试验（用于检测免病毒性出血病病毒抗体） 7.1在96孔V型微量凝集板上，自第1孔至第11孔，每孔加人PBS25μL，第12孔加人PBS50μL。 孔弃去25L。 7.3第1孔至第11孔，每孔分别加4个血凝单位的抗原25μL，摇匀，37℃温箱作用60min。 7.4每孔各加1%人"O"型红细胞25μL，立即置于微型振荡器上摇匀，于2℃~8℃冰箱静置45min， 待PBS对照孔的红细胞完全沉积后观察结果。 7.5每次测定应设已知效价的免病毒性出血病阳性血清对照、阴性血清对照，方法同7.1~7.4。 7.6每次测定应设4个血凝单位的抗原对照（回滴试验）：在微量凝集板第1孔至第5孔，每孔加人 PBS25μL。第1孔、第2孔各加4个血凝单位的抗原25uL，从第2孔起依次做倍比稀释至第4孔，弃 去25μL。1孔～4孔的抗原含量依次为4、2、1、1/2个血凝单位的抗原，第5孔为PBS对照。每孔各加 1%人“O"型红细胞25μL，立即置于微型振荡器上摇匀，于2℃～8℃冰箱静置45min，待PBS对照孔的 红细胞完全沉积后观察结果。 7.7结果判定 7.7.1试验结果成立条件 阴性血清血凝抑制效价小于2，阳性血清血凝抑制效价与已知效价不得相差一个滴度以上，4个血 凝单位抗原对照血凝效价为22。阴性对照、阳性对照和回滴试验同时成立，则表明试验成立。 7.7.2在对照出现正确结果的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制 效价。 7.7.3被检血清1：16（24)或更高稀释度的孔出现红细胞凝集完全抑制时，判为阳性 2 NY/T572—2016 附录A （规范性附录） 试剂的配制 A. 1 PBS(0. 1 mol/L,pH 7.0~7.2) 氯化钠（NaCI)（分析纯） 8g 氯化钾（KCI)（分析纯） 0.2 g 磷酸氢二钠（NazHPO·12H2O）（分析纯） 2.9g 磷酸二氢钾（KH,PO,）（分析纯） 0.2 g 制法：加人800mL双蒸水，HCI调pH至7.2.补双蒸水至1L，100kPa15min灭菌 A.2阿氏液(Alsever's) 葡萄糖（CH12O·H2O)（分析纯） 2.05 g 氯化钠（NaCI)（分析纯） 0. 42 g 柠檬酸钠（Na;CgH,O·2H,O)（分析纯） 0.8 g 柠檬酸（CH.O·H,O)（分析纯） 0.055g 双蒸水 100mL 制法：将以上药品混合加热溶解、过滤，68.94kPa15min灭菌，室温保存备用。 行业标准信息服务平台 3 NY/T572—2016 附录B （规范性附录） 重组VP60抗原的制备 B. 1 取经蚀斑纯化的重组杆状病毒rBAC-VP60.按 1%体积比接种Sf9昆虫细胞，逐日观察 B.2经3d~5d，待细胞病变明显时，收集细胞及上清液，-20℃以下冻融3次，离心，取上清液备用。 B.3取少量上清液进行血凝试验·血凝效价达到 B.5取少量灭活样品进行血凝 8℃，作为重组VP60抗原 备用。 G 服务平台 NY/T572—2016 附录B （规范性附录） 重组VP60抗原的制备 B. 1 取经蚀斑纯化的重组杆状病毒rBAC-VP60.按 1%体积比接种Sf9昆虫细胞，逐日观察 B.2经3d~5d，待细胞病变明显时，收集细胞及上清液，-20℃以下冻融3次，离心，取上清液备用。 B.3取少量上清液进行血凝试验·血凝效价达到 B.5取少量灭活样品进行血凝 8℃，作为重组VP60抗原 备用。 G 服务平台