ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 564—2016 代替NY/T564—2002 猪巴氏杆菌病诊断技术 Diagnostic techniques for swine pasteurellosis 行业标准信息服务平台 2016-10-26发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T564—2016 前 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T564—2002《猪巴氏杆菌病诊断技术》。与NY/T564—2002相比，除编辑性修 改外，主要技术变化如下： “范围”部分增述了多杀性巴氏杆菌定种的PCR鉴定方法和荚膜定型的多重PCR鉴定方法的 适用性（见1)； “临床诊断”及“病理剖检”部分参照《兽医传染病学》（陈薄言主编）中相关描述进行了修改（见 2和3）； “病原分离”部分删除了不适宜多杀性巴氏杆菌生长的麦康凯琼脂培养基，并将改良马丁琼脂 培养基和马丁肉汤培养基改为更适宜多杀性巴氏杆菌生长的胰蛋白大豆琼脂培养基和胰蛋白 大豆肉汤培养基（见4.1.1.1）； 新增了定种PCR鉴定方法（见4.4）； “英膜血清型鉴定”部分在原有的间接血凝试验（Carter氏膜定型法）的基础上又新增了另一 种选择一一多重PCR荚膜定型法，并对多杀性巴氏杆菌间接血凝试验程序表也进行了完善 （见4.5.1.3和4.5.2)； “附录A"部分增添了胰蛋白大豆琼脂培养基（TSA）和胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB)的制备方 法（见附录A.6和A.7)。 本标准由农业部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国兽医药品监察所。 本标准起草人：蒋玉文、张媛、李建、李伟杰、魏财文。 本标准的历次版本发布情况为： 行业标准信息服务平台 -NY/T5642002 I NY/T564—2016 猪巴氏杆菌病诊断技术 1 范围 本标准规定了猪巴氏杆菌病诊断的技术要求， 本标准所规定的临床诊断、病理剖检和病原分离鉴定.适用于猪巴氏杆菌病的诊断。定种PCR适 用于多杀性巴氏杆菌种的鉴定；间接血凝试验、荚膜定型多重PCR适用于多杀性巴氏杆菌荚膜血清型 的鉴定；琼脂扩散沉淀试验适用于多杀性巴氏 菌体血清型的鉴定 中闲团 2 临床诊断 RD 潜伏期1d 公 急性型和慢 形式 2.1最急性型 2.1.1突然发 2.1.2体温升高 C）.食欲爱绝·全 衰弱，卧地不起，焦躁 困难 心跳加快。 2.1.3颈 美部 C吸 红肿、坚硬 上延至耳粮 向后可达胸 及极度困难，常做犬坐姿 EARCI 势，伸长头 吸.有时 出喘鸣声，口身流出泡 2. 1. 4 可视黏 膜发维 腹侧、耳根和四肢内侧皮肤出现 2.1.5 病程 2.2急性型 U 2.2.1体 胸部有 高（40 有剧烈的疼痛，听诊有 中 啰音和摩擦 张口叶活 2. 2. 2 皮 可视黏 小面 2.2.3初便秘 2.2.4心脏衰 2.2.5病程5 2.3慢性型 2.3.1持续性咳嗽 吸困难，鼻 2.3.2出现痴样湿疹 2.3.3关节肿胀。 2.3.4食欲不振，进行性营养不良 极度消痕 3病理剖检 3.1最急性型 3.1.1皮肤有红斑；切开颈部皮肤时，可见大量胶冻样蛋黄或灰青色纤维素性黏液；咽喉部及其周围结 缔组织出血性浆液浸润；全身黏膜、浆膜和皮下组织有大量出血点；水肿可自颈部蔓延至前肢。 3.1.2全身淋巴结出血，切面红色 3.1.3心外膜和心包膜有小出血点。 3.1.4肺急性水肿。 3.1.5脾有出血，但不肿大。 1 NY/T564—2016 3.1.6胃肠黏膜有出血性炎症变化。 3.2急性型 3.2.1胸腔及心包积液；胸腔淋巴结肿胀，切面发红，多汁；全身黏膜、浆膜实质器官和淋巴结出血性病 理变化。 3.2.2纤维素性肺炎，肺有不同程度的肝变区，周围伴有水肿和气肿，病程长的肝变区内还有坏死灶， 肺小叶间浆液浸润，切面呈大理石样纹理；胸膜常有纤维素性附着物，严重的胸膜与病肺粘连。 3.2.3支气管、气管内含有多量泡沫状黏液，黏膜发炎。 3.3慢性型 3.3.1肺肝变区扩大并有黄色或灰色坏死灶，外面有结缔组织包裹，内含干酪样物质，有的形成空洞并 与支气管相通。 3.3.2心包与胸腔积液，胸腔有纤维素性沉着。 3.3.3肋膜肥厚，与病肺粘连；在肋间肌、支气管周围淋巴结、纵隔淋巴结以及扁桃体、关节和皮下组织 可见有坏死灶。 4病原分离鉴定 4.1病原分离 4.1.1材料 4.1.1.1培养基 胰蛋白大豆琼脂培养基（TSA，配制见A.6）、胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB,配制见A.7)。 4. 1. 1.2试剂 绵羊脱纤血、绵羊裂解血细胞全血、健康动物血清。 4.1.2器材 二级生物安全柜、恒温培养箱（37℃）。 4.1.3操作 猪死或死亡后，无菌采取病死猪的心血或肝脏组织，接种含4%健康动物血清的TSB.置35℃~ 37℃培养16h~24h。取TSB培养物划线接种含0.1%绵羊裂解血细胞全血和4%健康动物血清的 TSA平板，置35℃～37℃培养16h~24h。挑取在TSA平板上生长的光滑圆整的单个菌落传代接种 含0.1%绵羊裂解血细胞全血和4%健康动物血清的TSA平板，置35℃~37℃培养16h~24h，获得纯 培养物。 4.2病原鉴定 4.2.1材料 4.2.1.1待检样品 分离的细菌纯培养物。 4.2.1.2培养基 培养基质量满足GB/T4789.28规定的要求，按附录A方法配制改良马丁琼脂（配制方法见 A.4）、马丁肉汤（配制方法见A.5）、麦康凯琼脂（配制方法见A.13）、运动性试验培养基（配制方法见 A.8)。 4.2.1.3试剂 葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露醇、鼠李糖、戊醛糖、纤维二糖、棉子糖、菊糖、赤藓糖、戊五醇、M- 肌醇、水杨苷糖发酵小管（配制方法见A.10）、吲哚试剂（配制方法见A.11）、氧化酶试剂（配制方法见 A.12）、绵羊脱纤血、绵羊裂解血细胞全血、健康动物血清、革兰氏染色液、瑞氏染色液、1%蛋白陈水（制 2 NY/T564—2016 备方法见A.9）。 4.2.2器材 二级生物安全柜、显微镜、恒温培养箱（37℃）。 4.2.3镜检样品的制备 取病变组织肝或脾的新鲜切面在载玻片上压片或涂抹成薄层；用灭菌剪刀剪开心脏，取血液进行推 片，或取凝血块新鲜切面在载玻片上压片或涂抹成薄层；培养纯化的细菌从菌落挑取少量涂片。 4.2.4病原鉴定 4.2.4.1培养特性 4.2.4.1.1多杀性巴氏杆菌为兼性厌氧菌，最适生长温度为35℃～37℃。在改良马丁琼脂平血（含有 0.1%绵羊裂解血细胞全血及4%健康动物血清）上有单个菌落，肉眼观察光滑圆整，直径2mm~3mm 半透明，呈微蓝色。在低倍显微镜45°折光下观察，有虹彩，可见蓝绿色荧光（Fg菌落型）或橘红色荧光 (Fo菌落型）。 4.2.4.1.2改良马丁琼脂斜面生长纯粹的培养物，呈微蓝色菌苔或菌落。 4.2.4.1.3马丁肉汤培养物呈均匀混浊，不产生菌膜。 4.2.4.1.4麦康凯琼脂平血上不生长。 4.2.4.1.5含10%绵羊脱纤血的改良马丁琼脂平血上生长的菌落不出现溶血。 4.2.4.2显微镜鉴定 4.2.4.2.1样品的干燥和固定：挑取菌落，涂于载玻片，采用甲醇固定或火焰固定。 4.2.4.2.2染色及镜检：甲醇固定的镜检样品进行瑞氏或美蓝染色。镜检时，多杀性巴氏杆菌呈两极 浓染的菌体，常有荚膜。火焰固定的镜检样品进行革兰氏染色，镜检时多杀性巴氏杆菌为革兰氏阴性球 杆菌或短杆菌，菌体大小为（0.2~0.4）μm×（0.6~2.5）μm，单个或成对存在。 4.2.4.3生化鉴定特性 4.2.4.3.1接种于葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖和甘露醇发酵管产酸而不产气。接种于鼠李糖、戊醛糖、 纤维二糖、棉子糖、菊糖、赤藓糖、戊五醇、M-肌醇、水杨苷发酵管不发酵。 4.2.4.3.2接种于蛋白陈水培养基中，可产生吲哚。 4.2.4.3.3产生过氧化氢酶、氧化酶，但不能产生尿素酶、β-半乳糖苷酶。 标准信息服务平台 4.2.4.3.4维培(VP)试验为阴性 4.3毒力测定 4.3.1材料 4.3.1.1待检样品 从病料中分离的细菌纯培养物。 4.3.1.2培养基 马丁肉汤。 4.3.1.3试验动物 18g~22g小白鼠。 4.3.2器材 二级生物安全柜、恒温培养箱。 4.3.3操作 取马丁肉汤24h培养物，用马丁肉汤稀释为1000CFU/mL，皮下注射18g～22g小鼠4只，每只 0.2mL，另取相同条件小鼠2只，每只皮下注射马丁肉汤0.2mL作为阴性对照。 3 NY/T564—2016 4.3.4结果判定 观察3d～5d，阴性对照组小鼠全部健活试验方成立。注射细菌培养物组小鼠全部死亡者为阳性。 4.4培养物定种PCR鉴定 4.4.1材料 4.4.1.1待检样品 从病料中分离的细菌纯培养物。 4.4.1.2试剂的一般要求 除特别说明以外，本方法中所用试剂均 为分析纯级，水为符合 合GB/T6682规定的灭菌双蒸水或超 纯水。 4.4. 1.3 电泳缓冲液（TAE） 50XTAE储存液和1 4.4.1.41.5%琼脂糖凝胶 将1.5g琼脂糖干 粉加 微 凉脂糖熔化，待凝胶稍冷 水浴 却后加人溴化乙锭替 春代物 mL 4.4.1.5PCR配套试齐 10XPCRBuffer ag酶、Di QOODN 4.4.1.6PCR引物 根据kmtI 基因 序列设 商业合成.物序列见表B 4.4.1.7阳性对照 多杀性巴氏杆 4.4.1.8阴性对照 CENT 除多杀性巴氏 4.