ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T563—2016 代替NY/T563—2002 禽霍乱(禽巴氏杆菌病）诊断技术 Diagnostic techniques for fowl cholera (avian pasteurellosis) 行业标准信息服务平台 2016-10-26发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T563—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T563—2002《禽霍乱（禽巴氏杆菌病）诊断技术》。与NY/T563—2002相比，除 编辑性修改外，主要技术变化如下： “范围部分增述了多杀性巴氏杆菌PCR检测方法和英膜多重PCR鉴定方法的适用性（见1）； “病原分离”部分增加了多杀性巴氏杆菌生长的脑心浸出液琼脂培养基和脑心浸出液肉汤培养 基（见6.1)； 增加了多杀性巴氏杆菌PCR检测方法（见6.2)； 增加了用于多杀性巴氏杆菌荚膜型鉴定的多重PCR检测方法（见6.3）。 本标准由农业部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAT/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 本标准主要起草人：曲连东、郭东春、刘家森、姜骞、刘培欣。 本标准的历次版本发布情况为： -NY/T563—2002。 行业标准信息服务平台 I NY/T563—2016 禽霍乱（禽巴氏杆菌病）诊断技术 范围 1 本标准规定了禽霍乱的临床诊断和实验室诊断（病原分离鉴定、琼脂扩散试验、PCR检测方法和英 膜多重PCR检测方法）的技术要求 本标准所规定的临床诊断、病理剖检和病原分离鉴定，适用于禽霍乱的诊断；多杀性巴氏杆菌PCR 适用于多杀性巴氏杆菌种的鉴定：荚膜多重PC 于多杀性巴氏杆菌荚膜血清型的鉴定。 规范性引用文件 2 RD 下列文件对于 不可少的 仅注日期的版本适用于本文 用本 件。凡是不注日 用 本（包括活所有的修 期的弓 件 GB/T 47 生微生 勿学检验培养基和试剂 质量要 GB/T 分析美 金室用水规格和试验 方 NY/T 541 断样品采集保存和运输技术规范 3 术语和定义 下列术语 用于本 3. 1 禽霍乱 ol 又名禽巴 巴氏杆菌引起的家 们野禽的接鱼 菊传染 生细 CENT CUL 4 临床诊断 4.1症状 4.1.1急性型症状 急性感染的禽样 涎、腹泻、羽毛粗乱、呼 吸困难，临死前出 4.1.2慢性型症状 急性型耐过或由弱毒菌株感染的禽 其特征为 部感染，在关节、趾垫、腱鞘、胸 骨黏液囊、眼结膜、肉垂、咽喉肺、 、气囊、骨髓、脑膜等部位呈现纤维素性化脓性渗出、坏死或不同程度的 纤维化。 4.2病理变化 急性型的病变主要是淤血、出血，肝、脾肿大和局灶性坏死，肺炎、腹腔和心包液增多。慢性型主要 是局灶性化脓性渗出、坏死和纤维化。 5血清学检测方法：琼脂扩散试验（该方法不适用于水禽） 5.1试剂材料 5.1.1禽霍乱琼脂扩散抗原、标准阳性血清和标准阴性血清 按说明书使用。 5.1.2溶液配制 1 NY/T563—2016 1%硫柳汞溶液、pH6.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲(PBS)溶液和生理盐水，配制方法见A.1、A.2 和A.3。 5.1.3琼脂板 制备方法见B.4。 5.2操作方法 5.2.1打孔 在制备的琼脂板上，用直径4mm的打孔器按六角形图案打孔或用梅花形打孔器打孔。中心孔与 外周孔之间的距离为3mm。将孔中的琼脂挑出，勿伤边缘，避免琼脂层脱离平皿底部。 5.2.2封底 用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂微熔化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。 5.2.3加样 灭菌生理盐水（A.3)稀释抗原，用微量移液器将稀释的抗原加人到中间孔，标准阳性血清分别加人 外周的1孔、4孔中，标准阴性血清（每批样品仅做一次）和待检血清按顺序分别加入外周的2孔、3孔、5 孔、6孔中。每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个吸头。 5.2.4感作 加样完毕后，静止5min～10min，将平皿轻轻倒置，放人湿盒内，置于37℃温箱中作用，分别在24h 和48h观察结果。 5.3结果判定 5.3.1实验成立条件 将琼脂板置于日光灯或侧强光下观察，标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，标 准阴性血清与抗原孔之间不出现沉淀线，则试验成立。 5.3.2结果判定 符合5.3.1的条件。 a）若被检血清孔与中心孔之间出现清晰沉淀线，并与标准阳性血清孔与中心孔之间沉淀线的末 端相吻合，则被检血清判为阳性； b） 若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，但标准阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线一端在 被检血清孔处向中心孔方向弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性，应重复试验，如仍为可疑则 判为阳性； c）若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，标准阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线指向被检 血清孔，则被检血清判为阴性； d) 若被检血清孔与中心孔之间出现的沉淀线粗而混浊和标准阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线 交叉并直伸，待检血清孔为非特异性反应，应重复试验，若仍出现非特异性反应则判为阴性； 出现上述a)或b)的阳性结果，可判定禽体内存在禽霍乱抗体。 6病原学检测及鉴定方法 6.1病原分离鉴定方法 6.1.1样品采集 按照NY/T541的要求采集并保存样品：最急性和急性病例，可采集濒死或死亡禽只的肝、脾、心 血；慢性病例，一般采集局部病灶组织；活禽，通过鼻孔挤出黏液或将棉拭子插人鼻裂中采样。对不新鲜 或已被污染的样品，可采集骨髓样。 6.1.2镜检样品的制备 取病变组织肝或脾的新鲜切面，在载玻片上压片或涂抹成薄层；用灭菌剪刀剪开心脏，取血液进行 2 NY/T563—2016 推片，或取凝血块新鲜切面在载玻片上压片或涂抹成薄层；培养纯化的细菌，从菌落挑取少量涂片。 6.1.3培养基制备 培养基和试剂质量应满足GB/T4789.28的要求，按附录B方法配制5%鸡血清葡萄糖淀粉琼脂 (B.1)、鲜血琼脂培养基（B.2)、5%鸡血清脑心浸出液琼脂培养基（B.3)。 6.1.4细菌培养 将病料接种于5%鸡血清葡萄糖淀粉琼脂、鲜血琼脂培养基或5%鸡血清脑心浸出液琼脂培养基， 在35℃~37℃温箱中培养18h~24h，观察。 6.1.5病原鉴定 6.1.5.1培养特性 多杀性巴氏杆菌为兼性厌氧菌，最适生长温度为35℃～37℃，经18h～24h培养后，菌落直径为1 mm～3mm，呈散在的圆形凸起，露珠样，有荚膜菌落稍大。 6.1.5.2显微镜鉴定 a）样品的干燥和固定：挑取菌落，涂于载玻片，采用甲醇固定或火焰固定； b） 染色及镜检：甲醇固定的镜检样品进行瑞氏或美蓝染色，镜检时多杀性巴氏杆菌呈两极浓染的 菌体，常有荚膜。火焰固定的镜检样品进行革兰氏染色，镜检时多杀性巴氏杆菌为革兰氏阴性 球杆菌或短杆菌，菌体大小为（0.2~0.4μm）μm×（0.6~2.5μm）μm，单个或成对存在。 6.1.5.3生化鉴定特性 a)# 接种于葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖和甘露醇发酵管产酸而不产气，接种于鼠李糖、戊醛糖、纤维 二糖、棉子糖、菊糖、赤藓糖、戊五醇、M-肌醇、水杨苷发酵管不发酵； b) 接种于蛋白陈水培养基中，可产生吲哚； c） 鲜血液琼脂上不产生溶血； d) 麦康凯琼脂上不生长； e) 产生过氧化氢酶、氧化酶，但不能产生尿素酶、β-半乳糖苷酶； f) 维培(VP)试验为阴性。 6.1.5.4动物接种试验 细菌纯培养物计数稀释后，以1000CFU细菌经皮下或腹腔内接种小鼠、免或易感鸡，接种动物在 24h～48h内死亡，并可从肝脏、心血中分离到多杀性巴氏杆菌。 6.1.6结果判定 符合6.1.5.1.6.1.5.2，6.1.5.3和6.1.5.4的鉴定特征，可确认分离的病原为多杀性巴氏杆菌。 6.2多杀性巴氏杆菌PCR检测方法 6.2.1主要试剂 6.2.1.1试剂的一般要求 除特别说明以外，本方法中所用试剂均为分析纯级；水为符合GB/T6682要求的灭菌双蒸水或超 纯水。 6.2.1.2电泳缓冲液(TAE) 50XTAE储存液和1XTAE使用液，配置方法见A.5。 6.2.1.31.5%琼脂糖凝胶 将1.5g琼脂糖干粉加到100mLTAE使用液中，沸水浴或微波炉加热至琼脂糖熔化。待凝胶稍冷 却后加人溴化乙锭替代物，终浓度为0.5μg/mL。 6.2.1.4PCR配套试剂 DNA提取试剂盒、10XPCRBuffer、dNTPs、Taq酶、DL2000DNAMarker。 3 NY/T 563—2016 6.2.1.5PCR引物 根据kmtI基因序列设计、商业合成，引物KMTIT7、KMTISP6序列见附录C。 6.2.1.6阳性对照（模板DNA) 菌数达到108CFU/mL以上的液体培养基繁殖的多杀性巴氏杆菌C48-1株制备的DNA。 6.2.1.7阴性对照 灭菌纯水。 6.2.2样品处理 6.2.2.1组织样品的处理 取约0.5g的待检组织样品于灭菌干燥的研钵中充分研磨，加2mL灭菌生理盐水混匀，反复冻融3 次，3000r/min离心5min，取上清液转人 塑料离心管中，编 样本在2℃~8℃条件下 免反复冻赢 6.2.2.2纯化培养的细菌样品处理、 对分离鉴定和纯培养的 于无菌 科离心管中密封、编号、保存 和送检。 书提取6 中的组织、6.2 中的细菌 阳性对照、阴性对 照的基因组 DNA SEARCH 6.2.4反应体系及反应条件 提取的 6.2.4.1对6. DNA进行护地 组成如 2.3 艾应体 10XPCR dNTPs(2 引物KM T7 引物KMT 样品