ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T561-2015 代替NY/T561—2002 动物炭疽诊断技术 Diagnostic techniques for animal anthrax 行业标准信息服务平台 2015-10-09发布 2015-12-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T561—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T561-2002《动物炭疽诊断技术》，与NY/T561—2002相比，主要技术变化 如下： 增加了规范性引用文件（见2）； 增加了生物安全要求（见3）； 增加了炭疽细菌学检查操作流程（见5）； 增加了病料标本运输（见6.1.3）； 增加了PCR鉴定试验（见6.6）； 增加了陈旧动物病料和环境标本的细菌学检查（见7）； 修改了病料标本采集（见6.1.1和6.1.2)； 修改了细菌学检查的综合报告（见6.7）； 修改了皮张标本取样和皮张抗原的制备方法（见8.1和8.3)； 删除了雷比格尔氏荚膜染色法和荧光抗体染色法； 删除了青霉素串珠试验； 删除了非皮张类标本的沉淀试验检查。 本标准与世界动物卫生组织OIE编著《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2012年第7版）中有关炭 疽的诊断技术基本一致。 本标准由农业部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：军事医学科学院军事兽医研究所。 本标准主要起草人：冯书章、祝令伟、刘军、郭学军、孙洋、纪雪、周伟。 本标准的历次版本发布情况为： -NY/T 561--2002. 标准信息服务平台 I NY/T561—2015 动物炭疽诊断技术 1范围 本标准规定了动物炭疽芽孢杆菌的分离、培养及鉴定方法。 本标准适用于动物炭疽的诊断和检疫以及环境标本中炭疽芽孢杆菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 国务院【20041424号病原微生物实验室生物安全管理条例 农业部【2003]302号兽医实验室生物安全管理规范 农医发【200712号炭疽防治技术规范 3生物安全要求 3.1疑似炭疽病料标本的涂片、染色和镜检，以及灭活材料的PCR试验和沉淀试验操作应在BSL,-2 实验室进行。 3.2病原分离培养操作应在BSL-3实验室进行。 3.3采样过程中的个体防护按照农医发[200712号的规定执行，实验过程中的操作和个体防护按照 农业部20037302号的规定执行，推荐长期从事炭疽诊断的专业人员接种炭疽疫苗。 3.4所有可能受污染的物品应彻底灭菌处理，可能受污染的环境应消毒处理，灭菌及消毒方法按照农 医发[2007]12号的规定执行。 4材料准备 4.1器材 恒温培养箱、恒温水浴锅、高压灭菌锅、Ⅱ级生物安全柜、光学显微镜、台式离心机、CO2培养箱、 PCR扩增仪、电泳系统、紫外凝胶成像仪或紫外分析仪。 4.2培养基及试剂 普通营养肉汤、普通营养琼脂平板、5%绵羊血液琼脂平板（或5%马血液琼脂平板）0.7%碳酸氢 钠琼脂平板、PLET琼脂平板；碱性美蓝染色液、草酸铵结晶紫染色液、革兰氏碘液、沙黄复染液、TAE 电泳缓冲液、2%琼脂糖凝胶、上样缓冲液、0.5%苯酚生理盐水。配制方法见附录A。 4.3诊断试剂 国家标准炭疽沉淀素血清、炭疽皮张抗原、健康皮张抗原、炭疽诊断用标准菌体和Ⅱ号炭疽疫苗 菌株。 4.4实验动物 体重18g~22g清洁级实验用小鼠。 5操作流程 炭疽细菌学检查操作流程见图1。 1 NY/T561—2015 新鲜疑似炭疽动物病料标本 陈旧动物病料和环境标本 制备悬液 血液涂片或组织触片染色镜检 62℃~63℃水浴15min~20min 10倍梯度稀释1个~3个梯度，涂布 涂布琼脂平板培养基 PLET琼脂平板，37℃培养36h~48h 挑取扁平、灰白色、毛玻璃样、不溶血的粗糙型大菌落 噬菌体裂解试验 青霉素抑制试验 PCR鉴定试验 判定结果，出具诊断报告 图1 炭疽细菌学检查操作流程 6新鲜疑似炭疽动物病料标本的细菌学检查 6.1病料标本采集和运输 6.1.1疑似炭疽患病动物病料标本采集 疑似炭疽患病动物，自消毒的耳部或尾根部静脉采血1mL～3mL，或者抽取病变部水肿液或渗出 液以及天然孔流出的血性物，放置于无菌采样管中。取少许血液或组织液直接涂于载玻片上，自然干燥 后火焰固定，放置于载玻片盒中。 6.1.2疑似炭疽死亡动物病料标本采集 疑似炭疽死亡动物，针刺鼻腔或尾根部静脉抽取血液。已经错剖的疑似炭疽动物尸体，应立即停止 解剖活动，可抽取1mL~3mL血液或血性物，或者用无菌棉拭子蘸取组织切面采样，并做血液涂片或 组织触片，然后立即按照农医发[200712号的规定处理现场。 6.1.3病料标本运输 病料标本的包装和运输应符合国务院[20047424号的要求，运输时间超过1h，应在2℃～8℃条件 准信息 下运输。 6.2细菌染色法 6.2.1碱性美蓝荚膜染色法 6.2.1.1操作方法 滴加碱性美蓝染色液于载玻片涂抹面上，染色2min3min（如英膜不清楚，染色时间可稍延长）， 水洗、干燥、镜检。冲洗后的废水以及吸水纸经高压灭菌处理或者用10%次氯酸钠溶液处理过夜。 6. 2.1.2结果观察 镜下观察可见，炭疽芽孢杆菌菌体粗大，呈深蓝色，菌体外围荚膜呈粉红色。病料标本染色，菌体单 在、成对或呈短链条排列；培养物染色，菌体呈长链条排列。 6.2.2革兰氏染色法 6.2.2.1操作方法 滴加草酸铵结晶紫染色液于载玻片涂抹面上，染色1min，水洗。滴加革兰氏碘液，作用1min，水 洗。滴加95%乙醇，脱色约30s，水洗。滴加沙黄复染液，复染1min，水洗，干燥，镜检。废水以及吸水 2 NY/T5612015 纸如6.2.1.1处理。 6.2.2.2结果观察 镜下观察可见，炭疽芽孢杆菌呈蓝紫色，为革兰氏阳性的粗大杆菌，长3μm～5μm，宽0.8μm~1.2 um，有时可见椭圆形、小于菌体未着色的中央芽孢。病料标本染色，菌体单在、成对或呈短链条排列；培 养物染色，菌体呈长链条排列，两菌接触端平直。 6.3细菌分离培养 6.3.1操作方法 用接种环钓取血液、水肿液、渗出液等，划线接种于琼脂平板培养基表面；棉拭子标本直接涂于琼脂 平板培养基表面。置37℃培养18h～24h。挑取可疑菌落，接种于普通营养肉汤中，37℃培养4h~ 5h，涂片进行革兰氏染色镜检，并进行后续检测试验。 6.3.2结果观察 炭疽芽孢杆菌的菌落具有如下特征。 a）在普通营养琼脂平板上，形成扁平、灰白色、毛玻璃样、边缘不整齐、直径3mm～5mm的粗糙 型大菌落。用低倍显微镜观察，菌落呈卷发状，有的菌落可见拖尾现象。 b）在5%绵羊或马血液琼脂平板上，形成粗糙型大菌落，菌落周围不溶血。 c）在PLET琼脂平板上，生长受轻度抑制，需培养36h～48h，形成较小的毛玻璃样粗糙型菌落。 6.4噬菌体裂解试验和青霉素抑制试验 6.4.1操作方法 吸取100μL待检菌液均匀涂布于普通营养琼脂平板表面，自然干燥15min。用接种环钓取炭疽诊 断用标准噬菌体悬液一满环，点种于平板的一侧或划一短直线；在平板的另一侧贴1片含10U青霉素 的药敏纸片。同时，以Ⅱ号炭疽疫苗菌株培养的菌液作为阳性对照。37℃培养3h～5h。 6.4.2结果观察 噬菌体悬液滴加处细菌不生长，出现明显而清亮的噬菌斑（带），为噬菌体裂解阳性反应。青霉素纸 片周围细菌不生长，出现明显的抑菌环，为青霉素敏感菌株。如在培养平板上不出现或只出现不明显的 噬菌斑（带）和抑菌环，应将培养时间延长到12h～18h，再观察结果如前，应判为阴性反应；如出现明显 的噬菌斑（带）和抑菌环，判为阳性反应。 6.5英膜形成试验 6.5.1操作方法 用接种环钓取待检菌液划线接种于0.7%碳酸氢钠琼脂平板上，置20%二氧化碳条件下，于37℃培 养18h～24h。同时，以Ⅱ号炭疽疫苗菌株作为阳性对照。挑取菌落，涂片，碱性美蓝染色，镜检。 息服务平， 6.5.2结果观察 见6.2.1.2 6.6PCR鉴定试验 6.6.1 PCR 引物 台 炭疽芽孢杆菌PCR鉴定所使用的引物参见附录B。 6.6.2模板制备 吸取100μL待检菌液于带螺口盖的离心管中，12000r/min离心1min，菌体沉淀用25μL无菌去 离子水重悬；或者用接种环钓取可疑菌落于25μL无菌去离子水中混勾。95℃加热处理20min，冷却到 4℃后12000r/min离心1min取上清作为PCR反应的模板DNA。阳性对照为I号炭疽疫苗菌株制备 的模板DNA，阴性对照为不加菌的无菌去离子水。 6.6.3PCR反应 3 NY/T561—2015 6.6.3.1PCR反应体系 PCR反应总体系50uL，依次加人以下试剂： 无菌去离子水 27.5μL 不含镁离子10×Taq缓冲液 5 μL 15mmol/L氯化镁 5μl dNTP混合物（各2.5mmol/L） 5μlL 上游引物(PAF,50μmol/L;CAF或SAF,10μmol/L) 1 μL 下游引物(PAR,50μmol/L;CAR或SAR,10μmol/L) 1 μL 0.5 μL TaqDNA聚合酶（5U/μL） 模板DNA 5μL 6.6.3.2PCR扩增条件 95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃再延伸5min，冷却 至4℃。 6.6.4电泳 将PCR