ICS 11. 220 SB B 41 备案号：24729-2008 中华人民共和国国内贸易行业标准 SB/T104622008 肉与肉制品中肠出血性 大肠杆菌0157：H7检验方法 Method for the examination of entero-hemorrhagic E. coli 0157:H7 in meats and meat products 行业标准信息服务平台 2008-07-03发布 2008-12-01实施 中华人民共和国商务部 发布 SB/T10462-2008 前 言 本标准是在参考了SN/T 0973—2000《进出口肉与肉制品中肠出血性大肠杆菌0157:H7检验方 法》等标准及相关文献资料的基础上，通过试验和验证后制定。 本标准的附录 A是规范性附录。 本标准由中华人民共和国商务部提出并归口。 本标准由中华人民共和国商务部屠宰技术鉴定中心负责起草。 本标准主要起草人：赵志云、金社胜、王丽媛、吴爱华。 行业标准信息服务平台 1 SB/T10462—2008 肉与肉制品中肠出血性 大肠杆菌0157：H7检验方法 1范围 本标准规定了肉与肉制品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检验方法。 本标准适用于肉与肉制品中肠出血性大肠杆菌 0157:H7 的检验。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括期误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T4789.17食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验 GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 SN/T0973进出口肉与肉制品中肠出血性大肠杆菌O157:H7检验方法 3设备和材料 3.1刀子、剪刀、镊子、L棒、均质杯等。 3.2培养皿：直径90mm。 3.3吸管：1mL（具有分度值0.01mL）、5mL（具有分度值0.1mL）。 3.4移液器及吸头。 注：以上实验器材，在试验前应灭菌处理。 3.5显微镜：10×100×。 3.6均质器。 3.7冰箱：0℃~4℃。 3.8恒温水浴锅：100℃，65℃~68℃。 3.9生化培养箱:36℃±1℃,41℃±1℃。 准信息服务平 3.10天平：0~500g，感量0.1g。 3.11电热干燥箱。 3. 12 高压灭菌器。 4培养基和试剂 4. 1改良 E.C新生霉素增菌肉汤m(EC)n：（配方见第 A,1章)。 4.2山梨醇麦康凯平板（SMAC)：（配方见附录第A.2章）。 4.4普通琼脂：按GB/T4789.28—2003中4.7规定。 4.5半固体培养基：按GB/T4789.28—2003中4.30规定。 4.6三糖铁培养基：按GB/T4789.28—2003中4.26、4.27规定。 4.7胰蛋白陈肉汤：按GB/T4789.28—2003中3.13规定。 4.8MR-VP用培养基、试剂：按GB/T4789.28—2003中3.4规定。 1 SB/T10462—2008 4.9西蒙氏柠檬酸盐培养基：按GB/T4789.28—2003中3.5规定。 4.11糖发酵管（棉籽糖、纤维二糖和山梨醇）：按GB/T4789.28—2003中3.2规定。 5抽样 抽样数量及操作步骤按GB/T4789.17进行。 6检验程序 O157:H7检验程序见图1。 无茵称取样品25g 225mLm(EC)m增嘴41℃18h~24h 吸取10—,10-5、10-倍稀释液各0.1mL涂布于SMAC平板36℃18h～24h 非右述的结果 挑可爱菌落（中心淡褐色，扇平透 明，边续光滑，直径约2mm）接种 0.1%MUG-LST 挑取产气,无荧光者，接种普通营 养琼脂平板分离培养36℃18h~24h 0157:H7标准 TSI底、斜面+，H,S一，山 血清凝集试验 非右述的各种 梨醇、纤维二糖一，靛基质十; 反应结果 或 MR+, VP 一,柠榭酸 - 赖氨酸十，鸟氨酸十, EHEC O157:H7 棉籽糖+，有动力 乳胶证集试验 非上述的反应结果 非肠出血性大肠 非肠出红性大肠 出血性大肠 非肠出血性大肠 杆菌O157:H7 杆苗0157:H7 杆尚0157：H7 杆菌O157:H7 报告 图1肠出血性大肠杆菌0157:H7检验程序 2 SB/T10462—2008 7 操作步骤 7.1以无菌方法称取25g样品放入装有225mL灭菌的m（EC)n增菌肉汤的均质杯中，8000r/min 均质2min，加盖后置生化培养箱中,41℃士1℃培养18h～24 h。 7.2将增菌肉汤10倍递增稀释成10-4,10-5,10-6稀释液。 7.3用移液器分别吸取10-4、10-5、10-6稀释液各0.1mL，滴于SMAC平板上，以灭菌L棒涂布均 匀，于 36 ℃±1 ℃培养箱中培养 18 h~24 h。 7.4在每个平板上挑取可疑菌落5～8个，分别接种到LST-MUG肉汤中，放人培养箱36℃士1℃培 养24h（可疑EHECO157:H7菌落中心淡褐色，扁平透明，边缘光滑，直径约2mm）。 7.5挑选LST-MUG肉汤中产气无荧光者，接种普通琼脂平板，放人培养箱36℃士1℃培养18h~ 24 h. 7.6生化试验：取7.5培养后纯菌落分别接种各类生化培养基，置36℃士1C，除V-P靛基质试验培 养 48h后加试剂观察外，其他均在18h～24 h观察。具体内容见表1。 表 1肠出血性大肠杆菌0157:H7 生化学性状 生化试剂 生化特性反应 三糖铁培养基 底及斜面呈黄色，HzS阴性 山梁醇发酵 阴性或迟缓紫色不变 纤维二糖发酵 阴性紫色不变 胰蛋白陈肉汤 靛基质阳性出现红色环 MR-VP MR阳性变红色;VP阴性不变色 西蒙氏柠檬酸盐 阴性浅绿色不变 赖氨酸脱羧酶 阳性紫红色不变 鸟氨酸脱羧酶 阳性紫红色不变 动力试验培养基 有动力或无动力沿穿刺线扩散 棉籽糖发醇 阳性 变黄色 7.7结果报告：凡检测样品按上述方法分离出单个菌落（纯菌落），符合生化特性反应、0157H7标准 血清凝集试验或 EHEC O157:H7 乳胶凝集试剂测试,呈阳性结果者即可报告该检测样品中检出肠出 准信息服务平台 血性大肠杆菌 0157:H7。 3 SB/T 10462—2008 附录A （规范性附录） 培养基和试剂 A. 1 改良 E. C新生素增菌肉汤m(EC)n 胰蛋白陈 20.0 g 1.12 g 3号胆盐 乳糖 5.0 g 4.0 g 无水磷酸氢二钾 1.5 g 无水磷酸二氢钾 氯化钠 5. 0 g 水 1 000 mL 将上述成分溶于水后校正 pH至 6.9土1,分装后置 121℃高压灭菌15 min,取出后冷却至室温，以 过滤灭菌的新生素溶液20mg/L，使最终浓度为20μg/ml。 A.2山梨醇麦康凯平板（SMAC) 17.0 g 蛋白陈 脉陈 3. 0 g 5.0 g 猪胆盐（或牛羊胆盐） 氯化钠 5.0 g 琼脂 17.0 g 水 1 000 mL 山梨醇 10.0 g 0.01%结晶紫水溶液 10 mL 0.5%中性红水溶液 5. 0 mL 2. 5 mg 1%亚碲酸钾溶液（最终量为） 制法： a）将蛋白陈、脉陈、胆盐和氯化钠溶解于 400 mL蒸馏水中。校正 pH至 7.2,将琼脂加人于 600mL蒸馏水中加热溶解，将二液合并，分装于形瓶内，高压灭菌（121℃、15min备 用); b) 临用时加热融化琼脂，趁热加入山梨醇，冷却至50℃～55℃时加人结晶紫和中性红水溶液并 加人过滤除菌的亚酸钾溶液，使最终浓度为2.5mg/L,并加入头孢克(Cefixime),使最终 浓度为 0.05mg/mL。 A, 3月桂基磷酸盐胰蛋白陈(LST)MUG 肉汤 胰蛋白陈或胰酪(Tryptone) 20 g 氯化钠 5.0 g 乳糖 5. 0 g 2.75 g 磷酸氢二钾（K2HPO） 4 SB/T 10462--2008 磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75 g 0.1 g 月桂基磷酸钠 0.1g 四甲基伞形酮B葡萄糖醛苷酸(MUG) 水 1 000 mL 将以上成分溶解于蒸馏水中，分装到有倒立发酵管的试管中，每管10mL，于121℃高压灭菌 15min,最终pH6.8±0.2。 行业标准信息服务平台 5