ICS11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3237—2018 猪繁殖与呼吸综合征间接ELISA抗体 检测方法 Indirect ELISA for detection of antibodies against porcine reproductive and respiratorysyndromevirus 行业标准信息服务平台 2018-05-07发布 2018-09-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3237—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。 本标准主要起草人：刘湘涛、田宏、陈妍、吴锦艳、尚佑军、何继军。 行业标准信息服务平台 I NY/T3237—2018 猪繁殖与呼吸综合征间接ELISA抗体检测方法 1范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征间接ELISA抗体检测方法的技术要求。 本标准适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗体检测 2规范性引用文件 日期的版本适用于本文 件 GB19489实验室 生物安全道用品 GB/T27401 实验室质量 缩略语 本 下列缩略语适 适用 ELISA：酶联免疫吸附证 PBS：磷酸盐缓 sphate Buffered R 材料准备 4 4. 1 猪繁殖与 呼吸 综合征病毒GP5蛋白 GP5蛋白的表 与纯 见附录A 4.2 免抗猪Ig( 辣根过氧化物酶 试验前，用样品稀释液 4.3阳性对照血清 猪繁殖与呼吸 免疫仔猪制备：经间接免疫 RRSV抗体为 综 PRRS 疫苗 C 阳性。 人 4.4阴性对照血清 未免疫猪繁殖与呼吸综合征病毒疫及 感染猪繁殖 请与呼吸综合征病毒的仔猪血清，经间接免疫 荧光检测PRRSV抗体为阴性 4.5包被液 服务平台 配制见附录B中的B.1。 4.6PBS 配制见B.2。 4.7洗涤液 配制见B.3。 4.8封闭液 配制见B.4。 4.9稀释液 配制见B.5。 4.10底物溶液 1 NY/T3237—2018 配制见B.6。 4.11终止液 配制见B.7。 5仪器及设备 5.1酶标测定仪。 5.2恒温培养箱。 5.3微量移液器及配套吸头（20μL~200μL；100μL~1000μL）。 5.4酶标板。 5.51.5mL离心管。 5.6一次性注射器。 5.7稀释槽。 6血清样本的处理 6.1血清样本的采集和处理 静脉采血，每头猪使用一个注射器，采血量不少于2mL。将血液置于15℃~25℃静置2h，待其自 然凝固后，2℃~8℃冰箱中静置不少于2h，4000r/min离心10min。用移液器小心吸出上层血清。 6.2血清样本的储存与运输 一周以内检测的血清样本可置于2℃～8℃冰箱中保存，保存时间超过一周的样本应置于一20℃以 下冷冻保存。低温运送并及时送达，以确保血清样本有效。 7操作方法 7.1PRRSV重组抗原包被 取96孔微量反应板，每孔加人用包被缓冲液稀释至工作浓度的PRRSV重组抗原100uL （5μg/mL），置4℃过夜。 7.2洗板 弃去板中包被液，每孔加人220uL洗涤液，重复洗3次，甩掉洗涤液并在吸水纸上拍干残留液体。 7.3加封闭液 每孔加入封闭液200μL，置于37℃恒温箱内2h。封闭结束后，弃去板中的封闭液，于吸水纸上拍 干后，置于4℃保存备用。 7.4加待检血清、阳性对照血清及阴性对照血清 检样品及对照血清做两孔重复，置于37℃恒温箱内反应30min，取出反应板，弃去反应液，洗板同7.2。 7.5加酶标抗体 将兔抗猪IgG-辣根过氧化物酶用样品稀释液作1：40000稀释至工作浓度，每孔加人100μL，置 于37℃恒温箱内反应30min，取出反应板，弃去反应液，洗板同7.2。 7.6加底物溶液 每孔加人底物溶液100μL（TMB），置于37℃恒温箱内避光反应15min。 7.7终止反应 每孔加人终止液（2mol/LHzSO）100μL，终止反应。 7.8读数 2 NY/T3237—2018 在酶标测定仪上读取各孔吸光值（OD450mm）。 8结果分析 8.1试验成立条件 在酶标测定仪上检测各孔光吸收值（OD450mm），计算阳性对照平均OD450mm值和阴性对照平均 OD450mm值。阳性对照平均OD450mm值>1.0，阴性对照平均OD450mm值<0.2，试验成立。 8.2结果判定 计算待检血清平均OD450mm值和阴性对照孔平均OD450mm值之比。当样品孔平均OD450mm值（S）与阴 性对照平均OD450mm值（N)之比不低于2.4（即S/N≥2.40)时，判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳 性；当样品孔平均OD450mm值（S）与阴性对照平均OD450m值（N）之比小于1.90（即S/N<1.90时），判定 为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性；当S/N介于1.90和2.40之间则判定为可疑，应重测，重测后 S/N≥2.40判定为阳性，S/N<2.40判定为阴性。 9注意事项 9.1所有操作应严格按照GB19489和GB/T27401的规定执行。 9.2所有试剂需在2℃~8℃保存，使用前恢复至室温。 9.3操作时，注意取样、稀释准确、移液器进行校准，并注意更换吸头。 9.4底物溶液和终止液对眼睛、皮肤及呼吸道有刺激性作用，使用过程应注意防护，防止直接接触和 吸人。 9.5底物溶液应避光保存，避免与氧化剂接触。 行业标准信息服务平台 NY/T3237—2018 附录A （规范性附录） 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的表达与纯化 A.1材料和试剂 猪繁殖与呼吸综合征病毒NX/HY株、大肠杆菌JM109和BL21（DE3）、pGEX-6P-1载体、RNA 聚合酶、蛋白纯化试剂盒、Marc145胞 养集的为商 A.2引物序列 上游引物 5 GATCC GAATTCOTAGACACGACTCCATTG 下游引物P5R 1 S A.3方法 A.3.1GP5重组蛋白原核表达载体的构建 的条件下培养48h~ 与吸综合征病毒NX/HY株接种Marel 145细胞在 将猪繁殖 5%CO 72h。当70% 台糖凝胶电池 纯化回 收相 应的扩增片段， RNA，并反转 录成cDN 用上下游物 基因，坊 分别用限制性 内切酶 nHI和EcoRI 片段大小为650 B 载体片 用T 接4℃连接过夜。 在37℃双酶切 政 9，筛选获得阳性重组质粒，命名为 重组质粒转化大 转化大肠杆 菌感 P 肠杆菌BL21 DI 3感受 A.3.2 GP5重组自的最的表达与纯化 将2mL的阳性菌液加人 培养至OD60值达到0.6~ 28℃ 低温诱导12h后，收集菌液 000r/min离心5min，收 0.8时，加入终浓度 mmol 0007min.4℃离心 集菌体沉淀。菌体沉淀用PBS洗 min，收集上清液。上清液 步洗脱并收集目的蛋白洗肥液，即为纯化的 经GSTBind树脂纯化 标蛋白。 A.3.3重组蛋白的纯度及浓度测定 分别取5uL、2.5μ和1纯 AGE电泳，用凝胶成像仪成像并用薄层 扫描法测定蛋白纯度，蛋白纯度应≥90%。同时利用BCA法测定蛋白浓度，具体过程参见说明书，纯化 后蛋白浓度应0.2mg/mL。 4 NY/T3237—2018 附录B （规范性附录） 溶液的配制 B.1包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6) 碳酸钠（NazCO3，分析纯） 1. 59 g 碳酸氢钠（NaHCO3，分析纯） 2.93 g 蒸馏水 加至1000mL 溶解后，调节pH至9.6，4℃保存备用。 B.2 PBS(0. 01 mol/L PBS,pH 7. 4) 磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯） 0.2 g 十二水磷酸氢二钠（NazHPO12H2O，分析纯） 2.89 g 氯化钠（NaCl,分析纯） 8.0g 氯化钾（KCl，分析纯） 0.2g 蒸馏水 加至1000mL 溶解后，调节pH至7.4，4℃保存备用。 B.3洗涤液（含0.01mol/LPBS,0.05%吐温-20,pH7.4) 磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯） 0.2g 十二水磷酸氢二钠（NazHPO4·12H,O，分析纯） 2.89 g 氯化钠（NaCl,分析纯） 8.0g 氯化钾(KCI,分析纯） 0.2g 吐温-20 0.5mL 蒸馅水 加至1000mL B.4封闭液 B.5稀释液 10mL马血清，10mL大肠杆菌裂解液，加人PBST溶液定容至100mL，混匀。 B. 6 6底物溶液 B. 6. 1 底物溶液 A TMB(3,3',5,5-Tetramethylbenzidine，分析纯) 200 mg 无水乙醇 100mL 蒸馏水 加至1000mL B.6.2底物溶液 B 磷酸氢二钠（NazHPO4，分析纯） 71.7 g 5