ICS11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3234—2018 牛支原体PCR检测方法 PCR method for detectionof Mycoplasma bovis 行业标准信息服务平台 2018-05-07发布 2018-09-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3234—2018 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、华中农业大学、中国动物卫生与流行病学 中心。 本标准起草人：辛九庆、李媛、郭爱珍、宋建德、王岩。 行业标准信息服务平台 I NY/T3234—2018 引言 牛支原体（Mycoplasmabouis，Mbois）在分类上属于支原体目支原体科支原体属成员。虽然该病 原于1961年首次在美国患有乳房炎的病牛中分离到，但一直被认为是小反动物支原体一—无乳支原 体（Mycoplasmaagalactiae，Magalactiae）的一个亚种，直到1976年才被命名为牛支原体。 牛支原体是一种多形性的微生物，外观呈球形、星状、丝状，大小为（125150）μm×（0.2～ 0.8）μum，缺少细胞壁。能通过450nm滤膜，压挤下能通过220nm滤膜，与原生质体相似，但对渗透性 溶胞作用有较强的抵抗力，并且在原生质体溶解的条件下还能存活。其基因组大小约为1Mbp，G十C 含量为29.76%。 牛支原体已经在北美洲和欧洲等地广泛流行，并造成了严重的经济损失。主要引起牛的肺炎、关节 炎、乳房炎、中耳炎等，有时也会引起角膜结膜炎、子宫内膜炎、输卵管炎、卵巢炎、流产和精囊炎。这些 常见的疾病被统称为牛支原体相关疾病（Mycoplasmabouis-associateddisease，MbAD）。该病原已经 随着动物贸易的发展扩散到世界各地。 2008年，我国首次从患有肺炎的特牛肺脏中分离到牛支原体，目前已经广泛流行于全国各地，威肋 着我国的养牛业，并造成了巨大的经济损失。由于其临床表现和病理剖检变化与牛传染性胸膜肺炎（牛 肺疫相似，必须进行实验室诊断才能最终确诊。 行业标准信息服务平台 ⅡI NY/T3234—2018 牛支原体PCR检测方法 1 范围 本标准规定了牛支原体PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于实验室对牛肺组织、菌液培养物的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 GB19489 实验室生物 3仪器与试剂 3.1仪器 3.1.1台式高速离心机： 最大禽心 应不低手 S 3. 1.2 1.5mL离心 3.1.3 生物安全柜 超净士 或者 3.1. 4 PCR扩增仪及 的！ TUR 3.1.5 振荡混匀器 3.1.62℃~8℃冰箱 3. 1.7 电泳仪、电 3.1. 8 可调微量移液 3.2试剂 3.2.1电泳缓冲液（） 方法见附 3.2.2DNA分子量标 3.2.3除特殊说明外，所 学试剂 析纯 3.3引物及引物配制 上游引物：5-TTTTAGO TTT 下游引物：5'-GGCTCTCATTAAGAAT 引物用灭菌去离子水稀释至10 备用。 3.4牛支原体阳性样品及阴性样品的制备 以灭活前浓度为108CCU/mL的牛支原体菌液培养物 勿（由指定单位提供），经PCR检测无乳支原 体、丝状支原体和精氨酸支原体均为阴性后作为标准阳性样品；以健康牛肺脏样品（PCR检测牛支原体 阴性）为标准阴性样品；以灭菌ddH2O作为空白样品。 4样品采集与处理 4.1样品采集 选取有明显病变和健康交界处组织，无菌采集病牛肺脏，剪成3cm~5cm方块送实验室备用。 1 NY/T3234—2018 4.2样品处理 取0.5g待检样品（肺脏）于已洗净、灭菌并烘干的匀浆器中充分研磨，加10mL灭菌生理盐水混 匀，反复冻融3次，3000r/min离心15min。取上清液转人无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。 PCR试验中阳性对照样品使用3.4中的牛支原体菌液培养物。 样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h。若需长期保存，应放在一70℃冰箱或液氮中，但应避 免反复冻融。 5操作方法 5.1基因组DNA的提取 在样本制备区进行，有关生物安全和防止交叉污染的措施见附录B。 使用市售的DNA提取试剂盒提取组织、培养物种的DNA，具体操作参照试剂盒说明。 5.2PCR反应所用引物 使用3.3中配制好的引物溶液。 5.3PCR反应体系及反应条件 配置PCR反应体系在反应混合物配制区进行；加样在样本处理区进行。 PCR体系如下所示： 10XPCRBuffer(Mg?+free) 2.5μL 25mmol/LMgCl2 2.0μL 2. 5 mmol/L dNTPs 2.0μL 上游引物（10μmol/L） 0.5μL 下游引物（10μmol/L） 0.5μL 5U/μLrTaqDNA聚合酶 0.5μL 模板DNA 2.0μL 补ddH2O至总体积（Total) 25.0μL 瞬时离心，置PCR扩增仪内进行扩增。95℃预变性5min；循环95℃30s，52℃30s，72℃120s，30 个循环后72℃延伸10min。 5.4产物检测 使用0.8%琼脂糖凝胶在含有染料（EB或其替代物）的TAE缓冲液中进行电泳，在紫外观察仪或 标准信 者凝胶成像系统观察结果。 6结果判定 6.1试验成立的条件 标准阳性样品扩增出1.9kb片段而空白对照不能扩增出任何条带，则PCR反应判定为试验成立； 如标准阳性样品不能扩增出目的大小片段，或空白样品和标准阴性样品扩增出目的片段，则试验不成 立。 6.2检测结果判定 符合6.1的条件下，待检样品扩增出的DNA片段为1.9kb，可判定待检样品为牛支原体核酸阳 性；未出现1.9kb的DNA片段，则可判定待检样品为牛支原体核酸阴性。PCR检测结果判定标准图 例见附录C。 若需进一步确定，可对PCR产物进行测序。 2 NY/T3234—2018 附录A （规范性附录） 相关试剂的配置 A.1电泳缓冲液(TAE) A.1.150×TAE储存液 分别量取NazEDTA-2H,O37.2g、冰醋酸57.1mL、Tris-Base242g，用一定量（约800mL）的灭 菌双蒸水溶解。充分混匀后，加灭菌双蒸水补齐至1000mL。 A.1.2TAE使用液 取10mL储存液加490mL蒸馏水即可。 A.20.8%琼脂糖凝胶 将0.8g琼脂糖干粉加到100mLTAE使用液中，在沸水浴或者微波炉内加热至琼脂糖熔化形成 凝胶。待凝胶稍冷却后加人EB或替代物，终浓度为0.5μg/mL。 A.3磷酸盐缓冲液(PBS) 将8.0gNaCl、1.44gNazHPO4、0.2gKCI、0.24gKHzPO,于800mL去离子水中完全溶解，用 HCI调pH至7.4，加去离子水定容至1000mL，高压灭菌后储存备用。 行业标准信息服务平台 3 NY/T3234—2018 附录B （规范性附录） 检测过程中生物安全和防止交叉污染的措施 B.1样品处理和核酸制备 按照GB19489的要求，样品处理应在符合要求的分子生物学检测室中进行，并且严格执行有关的 口罩和帽子， 套要经常更换。 提取DNA过程或PCR 生物安全要求，穿实验服，戴 次性手套 工作台时，可选取一个相对洁净的 专用区域。 B.2PCR检测过程 B.2.1可用10%次氯酸钠各液擦拭工作 面和环境 保 B.2.2抽样和制样工 圣无菌处理，121c:15m-20min 套清洁工具仅限于 存放样品的 季器应该经过清洗灭菌或为一洗性火菌容器 个样品使用。 B.2.3扩增前 应检查各PCR管盖是否盖紧对于采用热盖加热PCR管中不 仪除要注意检查各 有CR 证热盖可以压紧所 友应管 B.2.4PCR实验 室应 PCR反应液配 制、PCR循环扩增 &PCR 文” 到“脏区”单 方向进行。 B.2.5所有的试剂 服务平台 4