ICS 11.220 NY B 41 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3233—2018 鸭坦布苏病毒病诊断技术 Diagnostic techniques for duck Tembusu viral disease 行业标准信息服务平台 2018-09-01实施 2018-05-07发布 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3233—2018 目 次 前言 引言 范围 1 2 规范性引用文件 缩略语 3 临床诊断 病毒分离鉴定 5 病毒特异性抗体检测 6 鸭坦布苏病毒病综合判定 附录A（规范性附录） 溶液试剂配制 附录B（资料性附录） 免疫荧光检测方法中所用坦布苏病毒的单抗 13 附录C（资料性附录） 阳性对照病毒（FX2010） 附录D（资料性附录） 样品的采集、处理、运输及保存 附录E（资料性附录） 坦布苏病毒特异反转录引物、RT-PCR、荧光RT-PCR的引物和探针 .17 附录F（资料性附录） ELISA抗原和血清标准 附录G（资料性附录） 鸭坦布苏病毒血凝抑制试验抗原 附录H（资料性附录） HI抗体检测的鸭血清处理方法 附录I（资料性附录） 检测过程防止交叉污染的措施 行业标准信息服务平台 I NY/T3233—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中国农业科学院上海兽医研究所、北京市农林科学院畜牧兽医研究所、中国动物 疫病预防控制中心、中国农业科学院兰州兽医研究所。 本标准主要起草人：李泽君、杨健美、李雪松、林健、滕巧決、闫丽萍、刘玉良、王小蕾、闫大为、顾小 雪、王宾宾、杨志远、朱启运、段会娟、刘立新。 行业标准信息服务平台 IⅡI NY/T3233—2018 引 自2010年春季以来，我国主要养鸭地区相继暴发一种引起鸭生长迟缓、高热、食欲不振、蛋鸭产蛋 下降乃至死亡的新发传染病。研究证实，引起该病的病原为坦布苏病毒（Tembusuvirus，TMUV），属 于恩塔亚病毒群（Ntayavirusgroup）、黄病毒属（Flavivirusgenus）。该病发病率高达100%，死亡率在 5%~30%，其传播速度快、感染性强，可引起各种日龄鸭采食下降高热和部分死亡，导致维鸭生长迟 缓、蛋鸭产蛋下降或停产，对养鸭业的危害巨大。坦布苏病毒病已造成养鸭业数以亿计的经济损失，是 截至目前，全国主要水禽养殖地区均已受到该病的威胁。 近年来危害养鸭业最严重的疾病 特异性针对坦布苏 毒鉴定和血清抗体检测进行综合判定。病每鉴定建立了3种检测方法运用 病毒E蛋白的单克隆抗体建立了病毒的细胞免疫荧光检测方法；运用针对地布苏病毒P-M蛋白的基因 特异序列设计引物，建 了病毒的RT 阻清抗体检测建立 PCR检测方法 2种检测方法， 设计了引物和荧光探 ，建立了病毒的荧光下 细胞的 的特性建立 S 了血凝抑制（HID抗体检测。 主述检测方法可根据实际情况因地制宜地选 意，声明符合本文件时，可能涉及个条款（5.2 2.3;6.1; 本文件的发布机构 购提请注 2 ：5 相关的 分高株及其单抗相关血凝抑制试验抗原、I抗体检测方 专利的 6.2；7.2)与坦布苏病事 R R 使用。 本文件的发布机构对于 利的真实性、有效性和范围无任何立场。 无歧视的条款和条件下 该专利持有人已 向本文件 十的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理日 信息可以通过以下 就专利授权许可进行诊 荧判J 专利持有人 C 联系方式获得： 学园门 专利持有人1：中国 兽医研究所专 2北京 紫月路 北京市海淀区曙光花园中路 地址1：上海市闵行 不承担识别这些专利 请注意除上述专 仍可能涉及 的责任。 务平台 II NY/T3233—2018 鸭坦布苏病毒病诊断技术 1范围 本标准规定了鸭坦布苏病毒病诊断技术的要求。 本标准所规定的临床症状和病理变化适用于鸭坦布苏病毒病的初步诊断；免疫荧光检测方法适用 于坦布苏病毒分离和鉴定，反转录-多聚酶链式反应（RTPCR）和荧光RT-PCR检测方法用于坦布苏 病毒的核酸鉴定，坦布苏病毒ELISA抗体检测方法和HI抗体检测方法适用于血清学诊断和免疫鸭群 抗体水平的检测。 2规范性引用文件 的 凡是 日期的！ 主日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新 包括所有的修改单适 析实验室用水规格和试 GB/T6682 分 方沃 实验室 生物安 通用要求 GB19489 兽医诊断样品采集保荐 NY/T541 016 检验实 验室技术要求 SN/T 1193 其庆 WS/T230 200 3 缩略语 下列缩略语适用 白（B) BSA：牛血清白蛋 DEPC：焦磷酸 DMEM：含各种氨 基酸和 E：囊膜糖蛋白（ OPE FBS:胎牛血清（P HA：血凝试验（He HI：血凝抑制（Hemagull) inm PBS：磷酸盐缓冲液（Phosph hateBuffer ne) PBST：吐温磷酸盐缓冲液(PhosphateB Sa Lween PCR：聚合酶链式反应（Polyme PrM：膜蛋白前体（Pre-Membrane RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（Reverse transcript Polymerase Chain Reaction) TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（TrisAcetate-EDTABuffer) 4临床诊断 4.1流行病学 一年四季均可发生，潜伏期3d～5d。不同日龄的麻鸭、北京鸭、樱桃谷鸭和鹅均易感，发病鸭群的 感染率高达100%，死亡率1%~15%不等。 4.2临床症状 维鸭感染后出现生长迟缓，产蛋鸭感染出现群体性采食量和产蛋量下降、甚至绝产。病鸭精神沉 1 NY/T3233—2018 郁、扎堆，羽毛逆立，拉绿色稀便；少量病鸭出现站立不稳、震颤、行走困难和姿势异常。继发感染、不当 的药物治疗或饲养管理不当等因素可使发病鸭的死亡率高达15%。 4.3病理变化 卵巢变性、坏死，卵泡变形、充血、出血和破裂，出现卵黄性腹膜炎，输精管萎缩。脾脏肿大。 4.4临床诊断结果判定 同时符合4.1、4.2、4.3判定为疑似鸭坦布苏病毒病。 5病毒分离鉴定 5.1病毒分离 5.1.1细胞分离 5.1.1.1仪器设备与耗材 5.1.1.1.1可调移液器：20μL、200μL、1000μL。 5.1.1.1.2高压蒸汽灭菌器。 5. 1. 1. 1. 3 3无菌离心管：1.5mL、15mL、50mL。 5. 1. 1. 1. 4 涡旋振荡器。 5. 1. 1. 1. 5 冰箱：2℃~8℃、-20℃、-80℃。 5. 1. 1. 1. 6 细胞培养箱。 5. 1. 1. 1. 7 细胞培养瓶、12孔细胞培养板。 5.1.1.2试剂 5.1.1.2.1磷酸盐缓冲液(PBS),见附录A中的A.1。 5.1.1.2.2DMEM细胞培养液。 5. 1. 1.2.3胎牛血清(FBS)。 5.1.1.2.4L-谷氨酰胺。 5.1.1.3细胞的准备 将生长良好的DF-1等敏感细胞用无菌PBS洗涤2次，弃去PBS，加人0.25%胰酶消化为单个细 胞，加人少量细胞培养液，用吸轻轻吹散细胞；再加入适量细胞培养液，用吸管轻轻吹打使细胞分散均 匀后，按每孔1mL加人到12孔细胞培养板；在37℃、含5%COz的细胞培养箱中培养24h~36h，密度 达到80%时用于病毒分离。 5.1.1.4样品接种和培养 将上述细胞培养液弃掉，用无菌PBS洗涤3次后，将处理好的样品加人到细胞上，每孔0.3mL～ 0.5mL。放人细胞培养箱吸附1h～2h，每隔15min轻轻摇动一次，吸附后弃掉液体，用无菌PBS洗涤 3次～5次，加入病毒培养维持液，每孔1mL。在细胞培养箱中培养36h～48h，收集出现病变的细胞上 清液。 5.1.1.5病毒分离结果判定 显微镜下观察，出现细胞变圆、不融合、不崩解的典型病变，判定为鸭坦布苏病毒疑似样品。 5.1.2鸡胚(或鸭胚)分离 5.1.2.1仪器设备与耗材 5.1.2.1.1可调移液器：200μL、1000μL。 5.1.2.1.2高压蒸汽灭菌器。 5.1.2.1.3无菌注射器：1mL、5mL。 2 NY/T3233—2018 5.1.2.1.4高压灭菌的剪刀、镊子。 5.1.2.1.5无菌离心管：1.5mL、15mL、50mL。 5.1.2.1.6冰箱：2℃~8℃、20℃、80℃。 5.1.2.1.7胚孵化箱。 5.1.2.1.8种蛋。 5.1.2.2种蛋准备 将鸡胚（或鸭胚）置于孵化器中37℃下孵育9d（鸭胚孵育10d~11d)，用于病毒分离。 5.1.2.3鸡胚（或鸭胚）接种 ，置37℃孵育，培养144h，弃去 将待检样品以0.1mL/胚的剂量经卵黄囊途径接种鸡胚（或鸭胚）， 24h内死亡胚，收集24h~144h死亡胚的尿囊液和胚体 5.1.2.4鸡胚（或鸭胚）分离结果判定 判定为鸭坦布苏 24h~144h引起鸡胚（或鸭胚） 病毒疑似样品。 5.2病毒检测方法 5.2.1免疫荧光技术 5.2.1.1仪器设备 与耗 5.2.1.1.1可调移液 5.2.1.1.2高压 5.2.1.1.3无菌 注身 5.2.1.1.4无菌 5.2.1.1.5涡旋振 器。 5.2.1.1.6冰箱 80 5.2.1.1.7细胞培 石 5.2.1.1.8细胞培 5.2.1.1.9荧光显德 5.2.1.2试剂 5.2.1.2.1DMEM细胞 5. 2. 1. 2. 2 胎牛血清(FBS 5. 2.1. 2. 3 牛血清白蛋白（B