(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210572834.4 (22)申请日 2022.05.24 (71)申请人 广东海洋大学 地址 524088 广东省湛江市麻章区海大路1 号 (72)发明人 江东能　彭友幸　黄远青　周一帆　 张强　邓思平　李广丽　 (74)专利代理 机构 广州知友专利商标代理有限 公司 44104 专利代理师 宣国华　刘艳丽 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 一种鉴定四棘金钱鱼遗传性别特异分子标 记的引物及应用 (57)摘要 本发明公开了一种鉴定四棘金钱鱼遗传性 别特异分子标记的引物， 所述引物包括正向引物 和反向引物， 所述正向引物的核苷酸序列如SEQ   ID NO： 3所示， 所述 反向引物的核苷酸序列如SEQ   ID NO： 4所示。 还公开了包括所述引物的试剂盒、 鉴定四棘金钱鱼遗传性别的方法以及所述引物、 试剂盒或方法引物在鉴定四棘金钱鱼遗传性别 方面的应用。 本发明的方法适用于实验室或观赏 鱼养殖企业准确鉴定四棘金钱鱼遗传性别。 本发 明检测四棘金钱鱼遗传性别的方法可用于对不 同生长阶段和不同群体的四棘金钱鱼性别鉴定 和筛选， 对研究金钱鱼科性别决定和分化机制， 以及实现其作为 性别筛选具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 CN 115181742 A 2022.10.14 CN 115181742 A 1.一种鉴定四棘金钱鱼遗传性别特异分子标记的引物， 其特征是： 所述引物包括正向 引物和反向引物， 所述正向引物的核苷 酸序列如S EQ ID NO： 3所示， 所述反向引物的核苷 酸 序列如SEQ  ID NO： 4所示。 2.一种鉴定四棘金钱鱼遗传性别的试剂 盒， 其特征是： 所述试剂 盒含有权利要求1中所 述的引物。 3.一种鉴定四棘金钱鱼遗传性别的方法， 其特 征是包括以下步骤： (S1)提取待测四棘金钱鱼样本的基因 组DNA； (S2)设计权利要求1中的引 物并以步骤(S1)提取的基因组DNA为模板， PCR扩增所述特 异分子标记或其部分片段， 所述特异分子标记为两条在四棘金钱鱼X和Y染色体中部 分同源 的DNA片段， 其中X染色体上DNA片段核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示， Y染色体上DNA片段核 苷酸序列如SEQ  ID NO2： 所示； (S3)将步骤(S2)的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳； (S4)分析电泳结果， 根据电泳结果判断四棘金钱鱼遗传性别， 判断标准 为： 当PCR扩增产物只有一条清晰的条 带， 则待测样本为X X基因型的雌鱼； 当PCR扩增产物有两条清晰的条 带， 则待测样本为XY基因型的雄鱼。 4.根据权利要求3所述鉴定四棘金钱鱼遗传性别的方法， 其特征是： 步骤(S2)中PCR扩 增的反应体系为2 ×PCR mix 12.5 μL， 10 μmol/L正反向引物各0.5 μL， 基因组DNA  1 μL， ddH2O  10.5 μL， 共25 μL。 5.根据权利要求3所述鉴定四棘金钱鱼遗传性别的方法， 其特征是： 步骤(S2)中PCR扩 增的程序为95℃3mi n； 95℃30s、 60℃30s、 72℃1mi n， 37个循环； 72℃10mi n延伸。 6.权利要求1所述的引物或权利要求2所述的试剂盒或权利要求3 ‑5任一项所述的方法 在鉴定四棘金钱鱼遗传性别方面的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115181742 A 2一种鉴定四棘金钱鱼 遗传性别特异分子标记的引物及应用 技术领域 [0001]本发明属于四棘金钱鱼技术领域， 具体涉及一种鉴定四棘金钱鱼遗传性别特  异 分子标记的引物及应用。 背景技术 [0002]观赏鱼是指包括金鱼、 锦鲤、 热带鱼及各种饲养在水族箱中供人们观赏的鱼  类。 体色是决定鱼类观赏和经济价值的重要衡量指标， 而许多雌雄观赏鱼类之间  的体色存在 着很大的差异。 其中在珍珠马甲鱼(Trichogasterleeri)(叶玲仙等， 2004)、  孔雀鱼 (Poecilia  reticulata)(张永明等， 2 017)和茉莉花鳉(Poecilia  latipinna)等  雄鱼的体 色更为艳丽， 背鳍、 尾鳍更加美丽。 观赏鱼大多为外来物种， 单性化养  殖可有效避免逃逸或 放生观赏鱼在野外繁殖， 进而限制入侵生物种群数量。 因此，  很有必要在销售观赏鱼的时 候只出售一种性别的鱼， 鉴定观赏鱼性别就具有应用  价值， 保证生态安全。 [0003]四棘金钱鱼(Scatophagus  tetracanthus)又称非洲金鼓， 隶属于鲈形目   (Perciformes)， 金钱鱼科(Sc atophagidae)， 分布于印度 ‑西太平洋区， 杂食性， 兼  具观赏 性和食用价值， 其中幼鱼可做为观赏鱼， 是人们喜爱的观赏鱼。 其在国内  观赏鱼市场价格 高， 成鱼约600元/尾。 通过性别鉴定特异分子标记， 筛选出雌  雄四棘金钱鱼进行单性化养 殖， 有助于避免四棘金钱鱼成为入侵生物， 具有重要  的生态效益。 四棘金钱鱼的近缘种金 钱鱼和多纹钱蝶鱼都具有 XY性别决定系统，  但目前还不清楚四棘金钱鱼性别决定类型。 性 别鉴定的关键在于开发性别特异或  连锁的分子标记， 用于遗传性别的快速鉴定。 但目前在 四棘金钱鱼中尚未发现与  遗传性别相关的特异分子标记。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种鉴定四棘金钱鱼遗传 性别特异分子标记的引物  和试 剂盒， 该引物和试剂盒可以简单 快速地实现遗传性别， 大 大节省时间和人力  物力。 [0005]本发明的目的还在于提供一种鉴定四棘金钱鱼遗传性别的方法。 [0006]本发明的最后一个目的在于提供上述引 物、 试剂盒或方法在鉴定四棘金钱鱼  遗 传性别方面的应用。 [0007]本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现： 一种鉴定四棘金钱  鱼 遗传性别特异分子标记的引物， 所述引物包括正向引物和反向引物， 所述正向  引物的核苷 酸序列如SEQ  ID NO： 3所示， 所述反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4所示。 [0008]具体的： [0009]正向引物F： 5 ′ ‑TGACCTAGTGGTGGAATGAATAGAAGA‑3′(SEQ ID NO： 3) [0010]反向引物R： 5 ′ ‑GAAGCAATATGAATGTGATGTG ‑3′(SEQ ID NO： 4)。 [0011]本发明还提供了一种鉴定四棘金钱鱼遗传性别的试剂盒， 所述试剂盒含有所  述 的引物。 [0012]本发明通过分子生物学和生物信息学方法分析四棘金钱鱼性别决定与分化  相关说　明　书 1/5 页 3 CN 115181742 A 3