(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210565090.3 (22)申请日 2022.05.23 (71)申请人 北京可瑞生物科技有限公司 地址 102200 北京市昌平区沙河镇能源东 路1号院1号楼3层317-2 (72)发明人 蒋栋　李雅真　翟佳慧　谢兴旺　 王江华　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 孙怡 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6858(2018.01) (54)发明名称 KRAS基因突变 检测引物组及其应用 (57)摘要 本发明涉及核酸检测技术领域， 具体公开了 KRAS基因突变检测引物组及其应用。 本发明将常 规PCR扩增、 LNA阻断引物与测序技术相结合， 建 立了一种简单快速、 高灵敏性、 高特异性且低成 本的KRAS基因突变检测方法。 本发明提供的阻断 引物可以选择性地与野生型DNA模板结合， 由于 阻断引物G12和G13对应位置采用LNA核苷酸， 阻 断引物与野生型DNA模板结合力强， 因此其一旦 与野型DNA结合便会阻止野生型DNA模板的扩增。 阻断引物对Taq  DNA聚合酶的5 ’外切酶活性不敏 感， 且不与突变型DNA模板 结合， 突变序列的扩增 不受影响而得到优势扩增， 野生序列扩增会明显 受到抑制。 结合PCR产物测序， 可对患者肿瘤组织 KRAS基因突变进行 快速检测。 权利要求书2页 说明书8页 序列表2页 附图4页 CN 114891888 A 2022.08.12 CN 114891888 A 1.KRAS基因突变检测引物组， 其特征在于， 包括引物KRAS ‑F2‑1、 KRAS‑R2‑1和阻断引物 KRAS‑BLK， 它们的核苷酸序列分别如SEQ  ID No： 1‑3所示： KRAS‑F2‑1： 5′ ‑AAACTTGTGGTAGTTGGAGCT‑3′； KRAS‑R2‑1： 5′ ‑CTACCCTCTCACGA AACTCTG‑3′； KRAS‑BLK： 5′ ‑PO4‑gagct(LNA)g(LNA)gtg(L NA)gcgta gg‑PO4‑3′； 其中， PO4表示磷酸 化修饰， LNA表示其右侧的核苷酸经锁核酸 修饰。 2.KRAS基因突变检测引物组， 其特征在于， 包括引物KRAS ‑F2‑2、 KRAS‑R2‑2和阻断引物 KRAS‑BLK， 引物KRAS ‑F2‑2的组成为： 5 ′ ‑P5‑Read 1‑KRAS‑F2‑1‑3′， 引物KRAS ‑R2‑2的组成 为： 5′ ‑P7‑KRAS‑R2‑1‑3′； 其中， KRAS ‑F2‑1、 KRAS‑R2‑1和KRAS‑BLK同权利要求1中所述。 3.根据权利要求2所述的引物组， 其特 征在于， P5的核苷酸序列如SEQ  ID No： 4所示。 4.根据权利要求2或3所述的引物组， 其特征在于， Read  1的核苷酸序列如SEQ  ID No： 5 所示。 5.根据权利要求2 ‑4任一项所述的引物组， 其特征在于， 在引物KRAS ‑F2‑2中Read1和 KRAS‑F2‑1之间插入如下Barcode序列中的任一个： 5′ ‑ATCACG‑3′； 5′ ‑CGATGT‑3′； 5′ ‑TTAGGC‑3′； 5′ ‑TGACCA‑3′； 5′ ‑ACAGTG‑3′； 5′ ‑GCCAAT‑3′； 5′ ‑CAGATC‑3′； 5′ ‑ACTTGA‑3′； 5′ ‑GATCAG‑3′； 5′ ‑TAGCTT‑3′； 5′ ‑GGCTAC‑3′； 5′ ‑CTTGTA‑3′； 5′ ‑AGTCAA‑3′； 5′ ‑AGTTCC‑3′； 5′ ‑ATGTCA‑3′； 5′ ‑CCGTCC‑3′； 5′ ‑GTCCGC‑3′； 5′ ‑GTGAAA‑3′； 5′ ‑GTGGCC‑3′； 5′ ‑GTTTCG‑3′； 5′ ‑CGTACG‑3′； 5′ ‑GAGTGG‑3′； 5′ ‑ACTGAT‑3′； 5′ ‑ATTCCT‑3′。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114891888 A 26.根据权利要求2 ‑5任一项所述的引物组， 其中， P7的核苷酸序列如SEQ  ID No： 6‑8中 的任一条 所示； 优选， P7的核苷酸序列如SEQ  ID No： 6所示。 7.含有权利要求1 ‑6任一项所述的KRAS基因突变 检测引物组的检测试剂或试剂盒。 8.权利要求1 ‑6任一项所述的KRAS基因突变检测引物组或权利要求7所述的检测试剂 或试剂盒在非疾病诊断和治疗目的的KRAS基因突变检测中的应用， 所述KRAS基因突变为 G12和/或G13突变。 9.权利要求1 ‑6任一项所述的KRAS基因突变检测引物组或权利要求7所述的检测试剂 或试剂盒在非疾病诊断和治疗目的的通过二代测序检测KRAS基因突变中的应用， 所述KRAS 基因突变为G12和/或G13突变。 10.一种通过二代测序检测KRAS基因突变的方法， 其特征在于， 包括使用KRAS基因突变 检测引物组对待测目标进 行PCR扩增的步骤， 所述KRAS基因突变检测引物组如权利要求2 ‑6 任一项所述。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114891888 A 3