(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210564228.8 (22)申请日 2022.05.23 (71)申请人 杭州快通科技有限公司 地址 310000 浙江省杭州市钱塘区下沙街 道围垦街850号4#办公大楼14层1401、 1409室 (72)发明人 赵俊　 (74)专利代理 机构 上海申新 律师事务所 31272 专利代理师 郎祺 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) (54)发明名称 一种引物组合物及其核酸扩增检测方法与 应用 (57)摘要 本发明涉及一种引物组合物及其核酸扩增 检测方法与应用； 引物组合物包括： 第一茎环引 物、 第二茎环引物、 通用引物以及前导引物； 第一 茎环引物的核苷酸序列自5 ’端至3’端依次包括： 第一茎序列、 突环序列、 第二茎序列以及第一引 物； 靶序列的互补序列与且仅与第一引物特异性 结合； 第二茎环引物的核苷酸序列自5 ’端至3’端 依次包括： 第一茎序列、 突环序列、 第二茎序列以 及第二引物； 靶序列与且仅与第二引物特异性结 合； 通用引物的核苷酸序列包括： 突环序列； 前导 引物与靶序列的互补序列特异性结合， 且前导引 物与靶序列的互补序列特异性结合的位点位于 第一引物与靶序列的互补序列特异性结合位点 的5’端上游。 权利要求书2页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 115094057 A 2022.09.23 CN 115094057 A 1.一种引物组合物， 用于核酸快速扩增与检测， 其特征在于， 包括： 第一茎环引物(1)、 第二茎环引物(2)、 通用引物(3)以及前导引物(4)； 其中， 所述第一茎环引 物(1)的核苷酸序列自5 ’端至3’端依次包括： 第一茎序列(11)、 突环序列(12)、 第二茎序列(13)以及第一引物(14)； 所述第一茎序列(11)、 所述突环序列 (12)以及所述第二茎序列(13)构成第一茎环结构， 靶序列的互补序列与且仅与所述第一引 物(14)特异性结合； 其中， 所述第二茎环引物(2)的核苷酸序列自5 ’端至3’端依次包括： 所述第一茎序列 (11)、 所述突环序列(12)、 所述第二茎序列(13)以及第二引物(21)； 所述第一茎序列(11)、 所述突环序列(12)以及所述第二茎序列(13)构成所述第一茎环结构， 靶序列与且仅与所述 第二引物(21)特异性结合； 其中， 所述 通用引物(3)的核苷酸序列包括： 所述 突环序列(12)； 其中， 所述前导引物(4)与所述靶序列的互补序列特异性结合， 且所述前导引物(4)与 所述靶序列的互补序列特异性结合的位点位于所述第一引物(14)与所述靶序列的互补序 列特异性结合 位点的5’端上游。 2.根据权利要求1所述的引物组合物， 其特征在于， 所述通用引物(3)为第一通用引物 (31)或/和第二通用引物(32)； 所述第一通用引物(31)以及所述第二通用引物(32)的核苷 酸序列均包括： 所述 突环序列(12)。 3.根据权利要求2所述的引物 组合物， 其特征在于， 所述第一通用引物(31)的核苷酸序 列为所述 突环序列(12)。 4.根据权利要求2所述的引物 组合物， 其特征在于， 所述第二通用引物(32)的核苷酸序 列自5’端至3’端依次包括： 具有第二茎环结构的信标序列(321)以及所述 突环序列(12)。 5.一种采用如权利要求1 ‑4任一项所述引物 组合物的核酸扩增检测方法， 其特征在于， 步骤包括： S1、 所述第二茎环引物(2)与RNA靶序列特异性结合， 在逆转录酶的作用下合成cDNA； S2、 所述第一茎环引物(1)与所述cDNA特异性结合， 在DNA聚合酶的作用下合成DNA； 由于所述前导引物(4)与所述cDNA特异性结合的位点位于所述第一茎环引物(1)与所 述cDNA特异性结合位点的5 ’端上游， 故而所述第一茎环引物(1)引导合 成的DNA被所述前导 引物(4)替换并成为ssDNA， 该ssDNA的核苷 酸序列自5 ’端至3’端依次包括： 所述第一茎环引 物(1)、 所述RNA靶序列逆转录合成的DNA序列以及所述第二茎环引物(2)的互补序列； S3、 在DNA聚合酶的作用下， 前一步骤获得的ssDNA， 自最末端的所述第二茎环引物(2) 的互补序列的3 ’端延伸合成dsDNA； S4、 所述通用引 物(3)与前一步骤合成的dsDNA中所述第二茎环引 物(2)中所述突环序 列(12)的互补序列特异性结合， 在DNA聚合酶的作用下， 合成包括所述第一茎环引物(1)的 互补序列的DNA； 由于前一步骤合成的dsDNA中未作为本步骤中DNA合成模板的核苷酸序列与本步骤新 合成的DNA的核苷酸序列相同， 故而前一步骤合成的dsDNA中未作为本步骤中DNA合成模板 的核苷酸序列被本步骤新 合成的DNA替换并成为s sDNA； S5、 在DNA聚合酶的作用下， 前一步骤获得的ssDNA， 自最末端的所述第一茎环引物(1) 的互补序列的3 ’端延伸合成dsDNA；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115094057 A 2S6、 所述通用引 物(3)与前一步骤合成的dsDNA中所述第一茎环引 物(1)中所述突环序 列(12)的互补序列特异性结合， 在DNA聚合酶的作用下， 合成包括所述第二茎环引物(2)的 互补序列的DNA； 同时， 前一 步骤合成的dsDNA成为s sDNA； S7、 循环步骤S3 至步骤S6若干次。 6.根据权利要求5所述的核酸扩增检测方法， 其特征在于， 所述核酸扩增检测方法采用 恒定温度扩增检测， 所述恒定温度扩增检测中的温度为 40℃‑70℃。 7.根据权利要求5所述的核酸扩增检测方法， 其特征在于， 所述DNA聚合酶为带链置换 的DNA聚合酶。 8.根据权利要求7所述的核酸扩增检测方法， 其特征在于， 所述DNA聚合酶选自Bst  DNA 聚合酶、 Bsu  DNA聚合酶、 Phi2 9 DNA聚合酶 或SD Taq DNA聚合酶中的至少一种。 9.一种如权利要求1 ‑5任一项所述引物组合物或如权利要求6 ‑8任一项所述核酸扩增 检测方法在制备病原体 检测试剂盒中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115094057 A 3