(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210565770.5 (22)申请日 2022.05.23 (71)申请人 普诺圣肽 （苏州） 生物科技有限公司 地址 215000 江苏省苏州市吴江区东太湖 生态旅游度假区 （太湖新城） 简村路 100号苏州湾智慧信息产业园17层 1701室10号工位 （集群登记） (72)发明人 马美荣　马丽荣　马桂连　赵真真　 (74)专利代理 机构 南京常青藤知识产权代理有 限公司 32 286 专利代理师 蔡赪劼 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种利用Cas13a蛋白检测呼吸道合胞病毒 的方法及其应用 (57)摘要 本发明涉及检测技术领域， 特别是涉及一种 利用Cas13a蛋白检测呼吸道合胞病毒的方法及 其应用， 该检测方法采用由呼吸道 合胞病毒基因 设计得到的RPA扩增引物组， 利用Cas13a蛋白、 所 述RPA扩增引物组、 crRNA、 RNA报 告分子和逆 转录 酶检测呼吸道 合胞病毒。 本发明提供的检测方法 将等温扩增和Cas13a蛋白检测有机 结合起来， 通 过管中一步法实现合胞病毒的扩增及检测， 该检 测方法方便快捷、 准确度高， 不需要大型仪器设 备， 不需要采用多对引物， 检测周期短， 检测灵敏 度高， 能够快速 灵敏的检出 结果。 权利要求书2页 说明书6页 序列表7页 附图2页 CN 114717362 A 2022.07.08 CN 114717362 A 1.一种利用Cas13a蛋白检测呼吸道合胞病毒的方法， 其特征在于， 采用由呼吸道合胞 病毒基因设计得到的RPA扩增引物组， 利用Cas13a蛋 白、 所述RPA扩增引物组、 crRNA、 RNA报 告分子和逆转录酶检测呼吸道合胞病毒， 所述RPA扩增引物组由上游引物和下游引物组成， 其中： 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示； 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.根据权利 要求1所述的利用Cas13a蛋白检测呼吸道合胞病毒的方法， 其特征在于， 所 述Cas13a 蛋白为LwaCas13a 蛋白。 3.根据权利 要求1所述的利用Cas13a蛋白检测呼吸道合胞病毒的方法， 其特征在于， 所 述逆转录酶为M ‑mLV逆转录酶。 4.根据权利要求1 ‑3中任意一项所述的利用Cas13a蛋白检测呼吸道合胞病毒 的方法， 其特征在于， 包括如下步骤： S1、 制备Cas13a蛋白： 具体包括构建表达载体pET ‑28a‑Cas13a、 构建重组工程菌和纯化 处理Cas13a 蛋白； S2、 基于Cas13a蛋白的特点， 将扩增的基因片段序列设计为能够特异识别阪崎肠杆菌 的crRNA； S3、 基于Cas13a蛋白的特点， 构建RNA报告分子； S4、 将呼吸道合胞病毒基因的核酸序列克隆至pUc57质粒中， 克隆位点为SamI， 培养、 提 取得到含有呼吸道合胞病毒基因片段的阳性质粒， 所述核酸序列如SEQ  ID NO.6所示； S5、 步骤S4得到的阳性质粒采用PCR扩增的方式反应得到扩增产物， 将扩增产物通过 RNA模板转录， 得到 工作标准品； S6、 配制Cas13a检测体系， 于常温等温扩增荧光检测仪中恒温反应10～60分钟， 得到检 测结果。 5.根据权利 要求4所述的利用Cas13a蛋白检测呼吸道合胞病毒的方法， 其特征在于， 所 述crRNA的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 6.根据权利 要求4所述的利用Cas13a蛋白检测呼吸道合胞病毒的方法， 其特征在于， 所 述RNA报告分子序列为： 荧光基团 ‑UUUUU‑淬灭基团， 所述荧光报告基团为FAM、 HEX、 TET、 JOE 或VIC中的任意 一种， 所述 荧光淬灭基团为BHQ1、 BHQ2或BHQ3中的任意 一种。 7.根据权利 要求4所述的利用Cas13a蛋白检测呼吸道合胞病毒的方法， 其特征在于， 其 特征在于， 步骤S5中， PCR扩增的体系包括如下组分： 引物1(10 μM)， 所述引物1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示； 引物2(10 μM)， 所述引物 2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示； Tap酶； 步骤S4得到的阳性质粒； 二次蒸馏水。 8.根据权利 要求4所述的利用Cas13a蛋白检测呼吸道合胞病毒的方法， 其特征在于， 步 骤S6中， Cas13a检测体系 包括以下组分： T7  RNA聚合酶、 NTPs(10mM)、 逆转录酶、 RNA报告分 子、 RPA扩增引物组、 crRNA、 RPA缓冲液、 步骤S4得到的工作标准品、 Cas13a蛋白(2.5mg/mL)、 醋酸镁(280mM)和二次蒸馏水。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114717362 A 29.根据权利 要求4所述的利用Cas13a蛋白检测呼吸道合胞病毒的方法， 其特征在于， 步 骤S6中， 检测时的反应温度为37～42℃。 10.一种如权利要求1所述的利用Cas13a蛋白检测呼吸道合胞病毒的方法在试剂盒中 的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114717362 A 3