(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210566494.4 (22)申请日 2022.05.23 (71)申请人 新疆农业大 学 地址 830052 新疆维吾尔自治区乌鲁 木齐 市沙依巴克区农大东路31 1号 (72)发明人 李斌　陈钢粮　裴文刚　李娜　 苏战强　付强　储岳峰　赵红琼　 许健　郭庆勇　高鹏程　 (74)专利代理 机构 北京轻创知识产权代理有限 公司 11212 专利代理师 赖定珍 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/35(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/46(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法、 特异性引物组、 试剂盒及应用 (57)摘要 本发明涉及生物技术领域， 具体而言， 涉及 快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法、 特异 性引物组、 试剂盒及应用。 包括如下引物对中的 至少两对： 检测大肠杆菌的引物对、 检测金黄色 葡萄球菌的引物对、 检测无乳链球菌的引物对、 检测粪肠球菌的引物对以及检测支原体的引物 对。 该方法采用特异性引物组对驼乳样品中提取 的样品总DNA进行多重PCR扩增， 检测所述驼乳中 是否含有上述五种致病菌； 并且当含有目标致病 菌时， 确定致病菌的种类。 该方法具有良好的特 异性、 敏感性和准确性， 样品需求量少， 对样品的 储存和运输条件要求低。 同时还具有成本低、 效 率高的优点。 权利要求书2页 说明书11页 序列表2页 附图4页 CN 114934128 A 2022.08.23 CN 114934128 A 1.一种检测双峰驼乳房炎主要致病菌的特异性引物组， 其特征在于， 包括如下引物对 中的至少两对： 检测大肠杆菌的引物对、 检测金黄色葡萄球菌的引物对、 检测无乳链球菌的引物对、 检 测粪肠球菌的引物对以及检测支 原体的引物对。 2.根据权利要求1所述一种检测双峰驼乳房炎主要致病菌的特异性引物组， 其特征在 于， 包括检测大肠杆菌的引物对、 检测金黄色葡萄球菌的引物对、 检测无乳链球菌的引物 对、 检测粪肠球菌的引物对以及检测支 原体的引物对。 3.根据权利要求2所述一种检测双峰驼乳房炎主要致病菌的特异性引物组， 其特征在 于， 所述检测大肠杆菌的引物对包括如SEQ  ID NO： 1所示的上游引物， 和如SEQ  ID NO： 2所 示的下游引物； 所述检测金黄色葡萄球菌的引物对包括如SEQ  ID NO： 3所示的上游引物， 和如SEQ  ID  NO： 4所示的下游引物； 所述检测无乳链球菌的引物对包括如SEQ  ID NO： 5所示的上游引物， 和如SEQ  ID NO： 6 所示的下游引物； 所述检测粪肠球菌的引物对包括如SEQ  ID NO： 7所示的上游引物， 和 如SEQ ID NO： 8所 示的下游引物； 所述检测支原体的引物对包括如SEQ  ID NO： 9所示的上游引物， 和如SEQ  ID NO： 10所 示的下游引物。 4.一种试剂盒， 其特征在于， 包括如权利要求1～3任意一项所述的特异性引物组及辅 助试剂。 5.如权利要求 4所述的试剂盒在快速检测双峰驼乳房炎主 要致病菌中的应用。 6.一种快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法， 其特征在于， 采用 如权利要求2或3 任意一项 所述的特异性引物组对驼乳样品中提取的样品总DNA进 行多重PCR扩增， 检测所述 驼乳样品中是否含有所述主要致病菌致病菌； 并且当含有所述主要致病菌时， 确定所述主 要致病菌的种类。 7.根据权利要求6所述一种快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法， 其特征在于， 支 原体、 无乳链球菌、 大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的最低检出浓度均为 1ng/ μL， 粪肠球菌的最 低检出浓度为10ng/ μL。 8.根据权利要求6所述一种快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法， 其特征在于， 包 括以下步骤： S1、 取所述驼乳样品， 将所述驼乳样品依次进行离心， 采用水煮法提取 所述样品总DNA； S2、 采用所述引物组对所述样品总DNA进行多重PCR扩增， 得到PCR产物； S3、 将所述PCR产物进行电泳检测， 根据电泳条带判断所述驼乳样品中是否含有致病菌 及致病菌的种类。 9.根据权利要求8所述一种快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法， 其特征在于， 所 述多重PCR扩增的反应体系为50 μL， 包括25 μL的2 ×预混聚合酶、 1μL的样品DNA、 1μL检测金 黄色葡萄球菌的上游引物、 1 μL检测金黄 色葡萄球菌的下游引物、 其他各上游引物和各下游 引物分别为0.5 μL,余 量为ddH2O； 所述多重PCR扩增的反应程序为： 预变性： 98℃、 5min； 变性： 95℃、 20s； 退火： 58℃、 30s；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114934128 A 2延伸： 72℃、 40s； 循环数： 3 0； 终延伸： 72℃、 10mi n。 10.根据权利要求8所述一种快速检测双峰驼乳房炎主要致病菌的方法， 其特征在于， 所述步骤S1中， 所述驼乳样品的体积为0.5～1mL。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114934128 A 3