(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210550478.6 (22)申请日 2022.05.20 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 郭爱珍　马耀争　胡长敏　陈颖钰　 朱杰　陈曦　陈建国　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 徐绍新 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于同时检测三种牛传染性病原的引物和 探针组合 (57)摘要 本发明公开一套用于同时检测牛病毒性腹 泻病毒(Bovine  viral diarrhea  virus， BVDV)、 牛轮状病毒(Bovine  Rotavirus， BRV)和牛冠状 病毒(Bovine  Coronavirus， BCV)的三重实时荧 光定量 PCR (Mul ti ple x  rea l‑time  fluorescence  quantitative PCR)引物和 探针 组合， 所述引物和探针 特异性针对B VDV病毒的5 ’ UTR基因片段、 BRV病毒的VP6基因片段、 BCV病毒 的N基因片段， 核苷酸序列如SEQ  ID No.1‑9所 示。 本发明只需要将样品进行一次PCR扩增即可 实现对三种病毒的定性或定量检测， 具有操作简 便、 特异性强、 灵敏度高、 重复性 好等优点。 权利要求书1页 说明书10页 序列表3页 附图5页 CN 114774588 A 2022.07.22 CN 114774588 A 1.一种用于同时检测牛病 毒性腹泻病 毒、 牛轮状病毒和牛冠状病毒的多重实时荧光定 量PCR引物和探针组合， 其特 征在于， 所述引物和探针组合 为： 用于检测牛病毒性腹泻病毒的上游引物序列如SED  ID NO:1所示， 下游引物序列如SEQ   ID NO:2所示， 探针序列如SEQ  ID NO:3所示； 用于检测牛轮状病毒的上游引物序列如SED  ID NO:4所示， 下游引物序列如SEQ  ID  NO:5所示， 探针序列如SEQ  ID NO:6所示； 用于检测牛冠状病毒的上游引物序列如SED  ID NO:7所示， 下游引物序列如SEQ  ID  NO:8所示， 探针序列如SEQ  ID NO:9所示。 2.根据权利要求1所述的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合， 其特征在于， 所述探 针的5’端标记荧 光基团， 3 ’端标记荧 光淬灭基团。 3.根据权利要求2所述的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合， 其特征在于， 所述用 于检测牛病毒性腹泻病毒的探针标记的荧光基团为HEX， 荧光淬灭基团为BHQ 1； 所述用于检 测牛轮状病毒的探针标记的荧光基团为 ROX， 荧光淬灭基团为BHQ2； 所述用于检测牛冠状病 毒的探针标记的荧 光基团为C Y5， 荧光淬灭基团为BHQ3 。 4.权利要求1 ‑3任一项所述的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合在非诊断目的同 时检测牛病毒性腹泻病毒、 牛轮 状病毒和牛 冠状病毒中的应用。 5.权利要求1 ‑3任一项所述的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合在制备同时检测 牛病毒性腹泻病毒、 牛轮 状病毒和牛 冠状病毒的试剂盒中的应用。 6.一种同时检测牛病毒性腹泻病毒、 牛轮状病毒和牛冠状病毒的试剂盒， 该试剂盒包 含权利要求1 ‑3任一项所述的多重实时荧 光定量PCR引物和探针组合。 7.一种非诊断目的同时检测牛病毒性腹泻病毒、 牛轮状病毒和牛冠状病毒的方法， 其 特征在于： 包括向反应体系中加入权利要求1 ‑3任一项所述的引物和探针组合并进行多重 实时荧光定量PCR扩增的步骤。 8.如权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述反应体系如下： 2 ×T5 Fast qPCR  Mix 12.5 μL； 用于检测牛病毒性腹泻病毒的上、 下游引物各0.7μL、 探针1.0 μL； 用于检测牛 轮状病毒的上、 下游引物各0.8 μL、 探针0.9 μL； 用于检测牛冠状病毒的上、 下游引物各0.8 μ L、 探针1.0 μL； 模板DNA  2 μL； 双蒸水补足至25 μL。 9.如权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述扩增的反应程序为： 95℃  5min； 95 ℃ 10s， 60℃退火3 0s， 共42个 循环， 在每 个循环结束时自动收集 荧光信号。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774588 A 2用于同时检测三种牛传染性病原的引物和探针组合 技术领域 [0001]本发明属于分子检测领域， 具体涉及一套用于同时检测牛病毒性腹泻病毒、 牛轮 状病毒以及牛 冠状病毒的引物和探针组合， 本发明还涉及该引物和探针组合的应用。 技术背景 [0002]牛病毒性腹泻病毒(Bovine  viral diarrhea  virus， BVDV)是引起牛病毒性腹泻 (Bovine viral diarrhea， BVD)的病原， B VDV病毒感染后表现出了广泛的临床表现， 包括急 性出血综合症、 长期持续病毒感染、 免疫力下降、 以及重度的呼吸道和胃肠道病变； 其中 BVDV感染后所造成繁殖障碍是其最严重的后果之一。 BVDV病毒感染后多呈现为持续性感 染， 部分感染牛外观健康， 抗体呈现阴性， 但该病毒的抗原呈现阳性， 这种持续性感染的牛 终身携带病毒， 对于其牛群的健康会造成极大影响， 从而给养牛业造成极大的损失。 [0003]牛轮状病毒(Bovine  rotavirus， B RV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridea)轮状病毒 属(Rotavirus)。 牛轮状病毒主要感染1月龄以内的犊牛， 其中1周龄以内犊牛最为易感， BRV 感染后， 病畜精神萎靡、 流涎、 不愿站 立且伴有严重的水样 腹泻， 尾部沾染黄 色稀水样粪便， 常由于机体抵抗力降低而引起继发性病菌传播， 而这种混合感染引起犊牛所产生的急性腹 泻病例增多， 死亡比例也更高。 而且BRV不同血清型在一定区域内发生基因重组或基因转 移， 使牛轮 状病毒病感染的情况愈发严重， 极大影响了畜牧业的经济效益。 [0004]牛冠状病毒(Bovine  Coronavirus， BCV)属于冠状病毒科， 冠状病毒属2 a亚群， 主 要引起新生犊牛腹泻， 还是成年牛冬痢和呼吸道感染的重要病原。 其中犊牛腹泻多发于8～ 10d龄， 潜伏期一般在1～2d， 可因衰竭而死并有较高的死亡率。 犊牛在感染BCV后， 精神沉 郁， 初期有轻微高热， 以后骤然出现水样腹泻， 大便为淡黄至乳白色， 然后迅速脱水并伴有 炎性消化道病变产生， 甚至在粪便中出现大量的血液或者血凝块； 成年牛在感染后出现冬 痢， 新患奶牛症状为突然发生的急性腹泻以及急剧下降的产奶量。 而且BCV 也可引起牛持续 性感染， 无症状但长期带毒， 给 牛群健康造成很大的威胁。 [0005]同时， 随着养牛业的发展， 大规模和集约化程度越来越高， 由BVDV、 BRV和BCV混合 感染所引起的犊牛腹泻病例显著增加， 给养牛业造成了极大的损失。 因此， 建立一种针对 BVDV、 BRV和BCV的快速敏感、 灵敏度高和特异性好的实验室检测方法对于及早做出临床诊 断和实施临床治疗具有非常关键的意义， 也可以用于犊牛腹泻的病原流行病 学研究。 目前 这三种病毒的主要诊断方法包括病毒的分离鉴定、 血清 中和试验、 ELISA技术、 PCR、 实时荧 光定量PCR技术等。 病毒的分离鉴定是金标准， 不过该方法操作繁琐， 诊断花费时间较长； 血 清中和试验 可用于病毒抗原检测， 特异 性较强， 但操作复杂， 需时较长； ELISA 技术也可用于 病毒抗原检测， 操作简单、 快速、 特异性较强， 但缺少商业化试剂盒， 且诊断敏感性较低； 传 统的PCR技术无法对模板DNA定量， 并且最后需要通过凝胶电泳才能判读， 操作相对冗长， 且 污染风险较大； 实时荧光定量PCR技术将荧光物质与传 统PCR技术结合， 不但可以对病原进 行精准定性和绝对定量， 并且其操作简单、 特异性好、 灵敏度高， 并且还能动态地研究整个 病程中潜在病原体的复活或持续感染； 多重实时荧光定量PCR技术能够精准迅速的检查出说　明　书 1/10 页 3 CN 114774588 A 3