(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210552523.1 (22)申请日 2022.05.20 (71)申请人 江苏宏微特斯医药 科技有限公司 地址 226499 江苏省南 通市如东县掘港街 道珠江路888号 （如东高新区生命健康 产业园） (72)发明人 陶海霞　杨红雷　赵佩佩　翟传新　 傅重阳　胡小许　冯华华　刘利成　 (74)专利代理 机构 北京玄法律师事务所 16 002 专利代理师 潘满根 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/725(2006.01) C12R 1/74(2006.01) C12R 1/72(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/43(2006.01) C12R 1/37(2006.01) C12R 1/22(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/45(2006.01) C12R 1/385(2006.01) C12R 1/46(2006.01) (54)发明名称 用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多 个病原体的试剂盒 (57)摘要 本发明提供一种用PCR扩增产物的熔点Tm值 实现单管检测多个病原体的试剂盒， 所述试剂盒 包括针对每个待测病原体设计特异性探针和下 游引物， 所述特异性探针一部分作为特异性上游 引物， 控制所述特异性上游引物的Tm值在50 ‑70 ℃， 所述探针的Tm值范围为60～80℃， 实现对每 个待测病原 体的荧光产物熔点Tm值的控制， 使得 同一荧光标记通道内不同的待测病原体的荧光 产物熔点Tm值通过PCR仪能够区分。 试剂盒分别 有内源性内参和外源性内参作为质控， 避免检测 的假阴性。 通过不同待测病原 体的带荧光标记的 PCR产物的Tm差异和/或不同的荧光标记， 实现多 个待测病原体的多重检测， 提高检测准确率， 节 省时间和成本以及样本量。 权利要求书4页 说明书23页 序列表20页 附图2页 CN 114934127 A 2022.08.23 CN 114934127 A 1.用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个病原体的试剂盒， 其特征在于， 所述试 剂盒包括： a.针对每个待测病原体设计特异性探针和下游引物， 所述特异性探针一部分作为特异 性上游引物， 控制所述特异性上游引物的Tm值在50 ‑70℃， 所述探针的Tm值范围为60～80 ℃， 实现对每个待测病原体的荧光产物熔点Tm值的控制， 使得同一荧光标记通道内不同的 待测病原体的荧光产物熔点Tm值通过PCR仪能够区分； 所述探针含至少1个RNA碱基， 在所述 RNA碱基左侧靠近所述探针5 ’端一侧的探针碱基上标记荧光基团， 在所述RNA碱基靠近所述 探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团； 在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值 高于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值； 所述下游引物及探针分别与各自待测 病原体特异性结合， 形成探针 ‑模板杂交双链， 且在所述RNA碱基处形成DNA ‑RNA杂交链； b.耐热核糖核酸酶RNaseH， 所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割与待测核酸序列结合的 RNA碱基， 使 得RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链， 而在所述RA N碱基 右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去； c.核酸聚合酶和dNTP， 在所述RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段作 为引物情况下， 所 述聚合酶使得待测病原体生成带荧 光标记的PCR产物。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 所述试剂盒是单管检测热带念珠菌、 光滑念珠菌、 阴 沟肠杆菌、 白色念珠菌、 金黄色葡萄球菌、 粘质沙雷菌、 奇异变形杆菌、 粪肠球菌、 肺炎克雷 伯菌的试剂盒， 它 们的引物和探针如下： 权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 114934127 A 23.根据权利要求2所述的试剂盒， 其中， 热带念珠菌、 光滑念珠菌、 白色念珠菌、 金黄色 葡萄球菌、 粘质沙雷菌、 奇异变形杆菌、 粪肠球菌、 和/或肺炎克雷伯菌引物的终浓度为0.1 ～0.3mM和探针的终浓度为0.05～0.2mM， 优选地， 热带念 珠菌引物的终浓度为0.1mM和探针 的终浓度为0.05mM； 和/或， 光滑念珠菌引物终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM； 和/ 或， 阴沟肠杆菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.1mM； 和/或， 白色念珠菌引物的 终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM； 和/或， 金黄色葡萄球菌引物的终浓度为0.2mM和 探针的终浓度为0.2mM； 和/或， 粘质沙雷菌引物的终浓度为0.2mM和探针的终浓度为0.1mM； 和/或， 奇异变形杆菌引物的终浓度为0.1mM和探针的终浓度为0.05mM； 和/或， 粪肠球菌引 物的终浓度为0.1mM和探针终浓度为0.05mM 时； 和/或， 肺炎克雷伯菌引物(KPN ‑R1)的终浓 度为0.1mM和探的终浓度为0.0 5mM时。 4.根据权利要求1所述的试剂 盒， 所述试剂 盒是单管检测的试剂 盒， 其检测的是鲍曼不 动杆菌、 大肠埃希菌、 表皮葡萄球菌、 屎肠球菌、 铜绿假单胞菌、 克柔念珠菌、 产酸克雷伯菌、 肺炎链球菌、 近平 滑念珠菌和无乳链球菌， 它 们的引物和探针如下： 权　利　要　求　书 2/4 页 3 CN 114934127 A 3