(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210548670.1 (22)申请日 2022.05.20 (71)申请人 中国人民解 放军陆军 军医大学 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正 街 30号 (72)发明人 向阳　邓铃　何晓奕　夏涵　 毛旭虎　 (74)专利代理 机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 1 1129 专利代理师 胡博文 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 基于RPA-LbCas12a体系可视化检测类鼻疽 的组合物及其应用 (57)摘要 本发明涉及分子诊断技术领域， 具体涉及一 种基于RPA ‑LbCas12a体系可视化检测类鼻疽的 组合物及其应用。 本发明提供用于检测类鼻疽伯 克霍尔德菌的组合物， 包括RPA引物、 crRNA、 LbCas12a蛋白酶和ssDNA荧光探针； 所述RPA引物 的核苷酸序列如SEQ  ID NO:5和SEQ  ID NO:6所 示； 所述crRNA的转录模板的核苷酸序列如SEQ   ID NO:7和SEQ  ID NO:9所示。 基于所述组合物， 本发明还提供一种检测类鼻疽伯 克霍尔德菌的 方法。 该方法通过RPA扩增与CRISPR ‑Cas12a系统 的结合， 获得了检测下限为2.7拷贝/μL的灵敏 度以及更 强的特异性， 并且能在1h内检出样本中 是否含有类鼻疽伯克霍尔德菌， 无需借助大型仪 器设备， 有助于 类鼻疽的快速诊断和筛查。 权利要求书1页 说明书11页 序列表4页 附图5页 CN 114807401 A 2022.07.29 CN 114807401 A 1.用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物， 其特征在于， 包括RPA引物、 crRNA、 LbCas12a蛋白酶和ssDNA荧光探针； 所述RPA引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:5和SEQ  ID  NO:6所示； 所述crRNA的转录模板的核苷酸序列如SEQ  ID NO:7和SEQ  ID NO:9所示。 2.根据权利要求1所述的组合物， 其特征在于， 所述ssDNA荧光探针的序列为TTATT， 其 5’端标记FAM荧 光报告基团、 3 ’端标记BHQ1淬灭基团。 3.根据权利要求1所述的组合物， 其特征在于， 所述组合物还包括重组酶聚合酶恒温扩 增(RPA)反应 体系所需的通用试剂和/或CRIS PR‑Cas12a切割体系所需的通用试剂。 4.权利要求1 ‑3任一所述的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物在制备用于检测类 鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用。 5.用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1 ‑3任一所述的 用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物。 6.权利要求1 ‑3任一所述的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物或权利要求5所述 的试剂盒在类鼻疽伯克霍尔德菌检测中的应用。 7.一种检测类鼻疽伯克霍尔德菌的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1.提取待测样品的基因 组DNA； S2.以待测样品 的基因组DNA为模板， 利用权利 要求1中所述的RPA引物进行重组酶聚合 酶恒温扩增反应， 得到RPA产物； S3.将权利要求1中所述的crRNA、 LbCas12a蛋白酶和ssDNA荧光探针与步骤S2得到的 RPA产物混合后进行CRIS PR‑Cas12a切割反应， 得到酶切产物； S4.对步骤S3得到的酶切产物进行荧光信号检测； 若酶切产物产生荧光， 则判断待测 样 品中含有类鼻疽伯克霍尔德菌； 若酶切产物无荧光产生， 则判断待测样品中不含有类鼻疽 伯克霍尔德菌 。 8.根据权利要求7 所述的方法， 其特 征在于， 所述 荧光信号检测的方法为如下a)或b)： a)将所述酶切产物置 于LED蓝光下， 裸眼观察酶切产物是否有荧 光产生； b)将所述酶切产物置于荧光定量仪中检测荧光强度； 若相对荧光单位 高于659， 则判断 待测样品中含有类鼻疽伯克霍尔德菌； 若相对荧光单位低于659， 则判断待测样品中不含有 类鼻疽伯克霍尔德菌 。 9.根据权利要求7或8所述的方法， 其特征在于， 所述重组酶聚合酶恒温扩增反应的体 系和条件为： Rehydration  Buffer 29.5 μL， 基因组DNA  5 μL， 10 μM  RPA正反向引物各2.4 μL， RNase‑free ddH2O 8.2 μL， 混匀后加入280mM  MgOAc 2.5 μL启动反应， 于 39℃反应20mi n。 10.根据权利要求7或8所述的方法， 其特征在于， 所述CRISPR ‑Cas12a切割反应的体系 和条件为： RNase  free ddH2O 5.2μL， DNase  I Reaction  Buffer 2μL， 1.34μg/μL   LbCas12a  1 μL， 1.67 μg/ μL crRNA 0.8 μL， 10 μM  ssDNA荧光探针1 μL， RPA产物10 μL， 混匀后置 于37℃反应3 0min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807401 A 2基于RPA‑LbCas12a体系可视化检测类鼻疽的组合物及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子诊断技术领域， 具体涉及一种基于 RPA‑LbCas12a体系可视化检测 类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物及其应用。 背景技术 [0002]类鼻疽(Melioidosis)是由类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkhol deria pseudomallei, Bp)经呼吸道气溶胶或皮肤破溃接触等途径感染所致的疾病， 其自然疫源地为我国海南与 东南沿海等亚热带地区。 随着近年来人口流动增加， 非自然疫源地也相继发生输入性病例。 目前BP感染尚无有效治疗方案， 无疫苗防护； Bp易获取、 易传播、 耐药广， 被列入国际 “生物 武器公约 ”核查清单、 美国CDC  I类生物恐怖剂； 感染临床表现 “隐匿”或“似百样病”。 若不及 时治疗， 极易发展为脏器脓肿甚至败血症， 临床死亡率10％～60％。 因此， 针对类鼻疽的快 速诊断极为重要。 [0003]目前类鼻疽的实验室诊断方法主要包括： 细菌分离培养、 血清学检测、 蛋白质组学 分析以及分子生物学方法等。 分离培养虽然 是感染诊断的金标准， 但是耗费周期 长， 易错过 最佳诊疗时机， 并且在没有相关经验时容易误鉴定为污染或同种属的其他细菌， 导致错误 治疗， 延误患者病情； 血清学检测由于窗口期以及疫区人群背 景干扰(海南当地人群血清 抗 体阳性率6％～20％)， 极易造成血清学检测假阴性或假阳性结果； 基于蛋白质组学分析的 细菌质谱鉴定对细菌样本的浓度和纯度有 所要求， 且由于地域差异和数据库更新滞后等原 因导致某些菌种的检测结果不稳定； 目前已报道的分子生物学方法主要是基于PCR方法以 及Lamp(环介导的等温扩增)， 检测 靶基因包括16s  rRNA以及III型和VI型分泌系统基因簇 等， 类鼻疽伯克霍尔德菌与泰国伯克霍尔德菌和鼻疽伯克霍尔德菌的16 s rRNA序列差异较 小， 极易导致鉴定错误； P CR方法在仪器条件、 人员操作等方面要求较高， 不适用于床旁快速 诊断(野外快速检测)； 并且Lamp方法容易形成气溶胶污染， 导致假阳性结果。 因此， 亟需提 供一种快速、 灵敏、 特异的类鼻疽检测方法。 发明内容 [0004]本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足， 提供一种用于检测类 鼻疽伯克霍尔德菌的组合物， 以满足对类鼻疽伯克霍尔德菌感染进行快速、 准确诊断的需 求， 能有效避免漏检和误检。 [0005]本发明提供的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物， 其特征在于， 包括RPA引 物、 crRNA、 LbCas12a蛋白酶和ssDNA荧光探针； 所述RPA引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:5和 SEQ ID NO:6所示； 所述crRNA的转录模板的核苷酸序列如SEQ  ID NO:7和SEQ  ID NO:9所 示。 [0006]所述ssDNA荧光探针的序列可以是TTATT， 其5 ’端标记FAM荧光报告基团、 3 ’端标记 BHQ1淬灭基团。 [0007]所述组合物还可以包括重组酶聚合酶恒温扩增(RPA)反应体系所需的通用试剂说　明　书 1/11 页 3 CN 114807401 A 3