(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210550159.5 (22)申请日 2022.05.20 (83)生物保 藏信息 CGMCC No.22650 2021.1 1.24 (71)申请人 中国农业科 学院生物技 术研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号中国农业科 学院生物技 术研究所 (72)发明人 王旭静　王志兴　杨江涛　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 李洋 (51)Int.Cl. C12N 15/84(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 9/10(2006.01)A01H 5/00(2018.01) A01H 6/46(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6813(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 1/02(2006.01) (54)发明名称 一种耐草铵膦转基因玉米BrmB01的制备与 检测方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种耐草铵膦转基因玉米 BrmB01的制备与检测方法及其应用。 该耐草铵膦 转基因玉米BrmB01已保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为 CGMCC No.22650。 本发明还建立了用于检测待测 植物样品是否来源于所述转基因玉米BrmB01的 PCR检测方法， 该检测方法可以鉴定插入的外源 DNA分子和植物 基因组DNA的接合区域， 进 一步可 用于准确快速的鉴定植物样品中是否包含特定 转基因玉米事件BrmB01的DNA分子， 为培育具有 优良性状的耐草铵膦玉米品种研究奠定 基础。 权利要求书2页 说明书11页 序列表5页 附图3页 CN 114736922 A 2022.07.12 CN 114736922 A 1.一种耐草铵膦转基因玉米的培育方法， 包括如下步骤： 将外源DNA分子插入目的玉米 基因组中， 得到耐草铵膦转基因玉米； 所述外源DNA分子为含有草 丁膦乙酰CoA转移酶编码基因的DNA分子； 所述外源DNA分子在所述耐草铵膦转基因玉米 中的上游侧 翼序列为上游插入位点起向 其上游方向延伸得到的任意 一个DNA片段； 所述外源DNA分子在所述耐草铵膦转基因玉米 中的下游侧 翼序列为下游插入位点起向 其下游方向延伸得到的任意 一个DNA片段； 所述上游插入位点为玉米基因组中含有的SEQ  ID No.1第1‑516位所示的DNA分子中的 最后一个核苷酸对应的位 点； 所述下游插入位点为玉米基因组中含有的SEQ  ID No.1第2664 ‑3034位所示的DNA 分子 中的第一个核苷酸对应的位 点。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述耐草铵膦转基因玉米含有特异DNA片 段； 或， 所述特异DNA片 段含有SEQ  ID No.2所示的DNA 分子和/或SEQ  ID No.3所示的DNA 分 子； 或， 所述特异DNA片 段含有SEQ  ID No.4所示的DNA 分子和/或SEQ  ID No.5所示的DNA 分 子； 或， 所述特异DNA片段依次由所述上游侧翼序列、 所述外源DNA分子和所述下游侧翼序 列组成； 或， 所述外源DNA分子如SEQ  ID No.1第517 ‑2663位所示； 或， 所述上游侧翼序列如SEQ  ID No.1第1‑516位所示； 或， 所述下游侧翼序列如SEQ  ID No.1第2664‑3034位所示； 或， 所述特异DNA片段如SEQ  ID No.1所示； 或， 所述耐草铵膦转基因玉米为 转基因玉米事 件BrmB01 CGMCC No.22650。 3.一种耐草铵膦转基因玉米的培育方法， 包括如下步骤： 以按照权利要求1或2所述方 法培育的耐草铵膦转基因玉米或其后代为亲本材料与其它不具有草铵膦耐受性的玉米品 种进行杂交， 得到耐草铵膦转基因玉米； 所述 耐草铵膦转基因玉米含有权利要求2中所述的 特异DNA片段。 4.如下1) ‑4)任一所述的生物材 料： 1)权利要求1或2中所述的上游侧翼序列； 2)权利要求1或2中所述的下游侧翼序列； 3)权利要求1或2中所述的外源DNA分子； 4)权利要求1或2中所述的特异DNA片段。 5.权利要求 4所述的生物材 料在如下a1)或a2)任一种中的应用： a1)培育权利要求1 ‑3中任一所述的耐草铵膦转基因玉米； a2)检测或辅助检测植物样品是否来源于权利要求1 ‑3中任一所述的耐草铵膦转基因 玉米或其后代。 6.用于检测或辅助检测植物样品是否来源于权利要求1 ‑3中任一所述的耐草铵膦转基 因玉米或其后代的方法， 包括如下步骤： 检测所述植物样品的基因组DNA中是否含有权利要权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114736922 A 2求2中所述的特异DNA片段， 若含有 所述特异DNA片段， 则所述植物样品来源于所述 耐草铵膦 转基因玉米或其后代。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于： 检测所述植物样品的基因组DNA中是否含 有权利要求2中所述的特异DNA片段的方法为如下b1)或b2)或b3)： b1)直接测序所述植物样品的基因组DNA， 根据测序结果判断所述植物样品中是否含有 所述特异DNA片段； b2)采用引物对1和/或引物对2对所述植物样品的基因组DNA进行PCR扩增， 若有目的扩 增产物， 则所述 植物样品含有所述特异DNA片段； 所述引物对1为扩增产物含有DNA片段甲 的引物对； 所述DNA片段甲如SEQ  ID No.2； 所述引物对2为扩增产物含有DNA片段乙的引物对； 所述DNA片段乙如SEQ  ID No.3； b3)用能特异结合所述特异DNA片段的探针对所述植物样品 的基因组DNA进行Southern 杂交， 若能杂交得到杂交片段， 则所述 植物样品含有所述特异DNA片段。 8.根据权利要求7 所述的方法， 其特 征在于： b2)中， 所述引物对 1由SEQ ID No.6所示的单链DNA分子和SEQ  ID No.7所示的单链DNA 分子组成； 所述引物对2由SEQ  ID No.8所示的单链DNA分子和SEQ  ID No.9所示的单链DNA 分子组成； b3)中， 所述探针的核苷酸序列为SEQ  ID No.12。 9.用于检测或辅助检测植物样品是否来源于权利要求1 ‑3任一所述方法制备的耐草铵 膦转基因玉米或其后代的试剂盒， 其包括权利要求7或8中所述的引物对1和/或权利要求7 或8中所述的引物对2和/或权利要求7或8中所述的探针。 10.权利要求1 ‑3任一所述的方法或按照权利要求1 ‑3任一所述方法制备的耐草铵膦转 基因玉米或其后代或权利要求4所述的生物材料或权利要求6 ‑8任一所述的方法或权利要 求9所述的试剂盒在玉米育种或加工品生产中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114736922 A 3