(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210548579.X (22)申请日 2022.05.20 (71)申请人 吉林省农业科 学院 地址 130000 吉林省长 春市净月区生态大 街1363号 (72)发明人 曹阳　肖成　刘宇　崔超　赵中利　 翟博　马惠海　金海国　 (74)专利代理 机构 沈阳一诺君科知识产权代理 事务所(普通 合伙) 2126 6 专利代理师 刘丽娟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种降低羊肉滴水损失的ATG5基因的单倍 型组合的筛 选方法 (57)摘要 本发明公开了一种降低羊肉滴水损失的 ATG5基因的单倍型组合的筛选 方法， 选用ATG5基 因的单倍型 组合作为遗传标记进行早期选择， 多 SNP位点组成的有效单倍型组合对于24小时、 48 小时、 72小时的滴水损失均有效， 相比普 通的SNP 位点的选 择具有更好的准确性和稳定性； 通过 发 明的实施， 可以在羊出生时早期选择肌肉系水力 高的肉羊个体进行培育或生产， 提高羊肉品质。 缩短了时间间隔(常规方法需要饲养至屠宰后才 可以判断)4 ‑6个月， 节省了人力、 物力等经济成 本。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 114921564 A 2022.08.19 CN 114921564 A 1.一种降低羊肉滴水损失的ATG5基因的单倍型组合的筛选方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： S1、 采集待测羊只的血 液， 提取待测羊只基因 组DNA； S2、 设计ATG5基因引物， 并使用设计 的ATG5基因引物对待测羊只基因组DNA进行PCR扩 增， 获得PCR扩增产物， 然后对PCR扩增产物进行测序； S3、 将PCR扩增产物的测序结果通过DNAMAN、 Chromas软件进行比对以确定其有效突变 位点， 然后进行基因分型； S4、 根据待测羊中每个个体对应的基因型进行遗传多样性分析， 计算基因频率及基因 型频率， 判断各个位点是否处于哈迪温伯格平衡状态， 其中： 基因频率表 示ATG5基因各突变 位点的等位基因在群体中的比例， 基因型频率表示ATG5基因各突变位点产生的不同基因型 在群体中的比例； S5、 针对检测到 的有效突变位点， 利用Haploview软件进行单倍型分析， 并对每一个个 体所对应的单倍型组合进行确定， 选留单倍型组合H1H2的待测羊个 体。 2.根据权利要求1所述的降低羊肉滴水损失的ATG5基因的单倍型组合的筛选方法， 其 特征在于， 所述 步骤S2具体包括： 根据GenBank中公布的绵羊ATG5基因的序列信息及Ensemble网站确定其外显子1的边 界， 利用Pri mer Premier 5.0软件设计引物， 上游引物序列如SEQ  NO.1所示， 下游引物序列 如SEQ NO.2所示； PCR反应体系为20 μL： 2 ×ES Taq Master Mix 10 μL， 上、 下游引物各0.5 μ L， DNA1 μL， ddH2O为8 μL， PCR反应程序为： 95℃预变性5min， 95℃变性30s， 56.5℃退火30s， 72 ℃延伸23s， 从第二步开始共34个循环； 72℃延伸8min； 4℃保存； 然后将条带明亮的PCR扩增 产物进行sanger测序。 3.根据权利要求2所述的降低羊肉滴水损失的ATG5基因的单倍型组合的筛选方法， 其 特征在于： 所述PCR扩增产物长度为746bp。 4.根据权利要求1所述的降低羊肉滴水损失的ATG5基因的单倍型组合的筛选方法， 其 特征在于， 所述 步骤S3具体包括： 将PCR扩增产物的测序结果通过DNAMAN软件进行比对以确定其有效突变位点， 有效突 变位点为： ATG5基因第1外显子 的S1:G61T、 S2:A64G和S3:T215C等3个突变位点； 随后利用 Chromas软件对测序 峰图逐一比对确认， 每个位点分别有3种基因型， 分别为61bp处的GG、 TT、 GT； 64bp处的A A、 GG、 AG； 215bp处的T T、 CC、 TC。 5.根据权利要求2所述的降低羊肉滴水损失的ATG5基因的单倍型组合的筛选方法， 其 特征在于， 所述上游引物序列为F:5'GATGGAGGGCTTCAGTATTCAG  3'； 下游引物序列为R:5' CCCTCCTTTTTACCACACCTAC 3'。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921564 A 2一种降低 羊肉滴水损 失的ATG5基因的单倍型组合的筛选方 法 技术领域 [0001]本发明涉及动 物遗传育种领域， 特别是一种降低羊肉滴水损失的AT G5基因的单倍 型组合的筛 选方法。 背景技术 [0002]随着人民生活水平的提高， 对肉类的需求不断增加， 羊肉以其肉质细嫩、 味道鲜 美、 营养丰富等特点备受消费者青睐， 高品质羊肉产品已成为人们饮食需求的重要组成部 分， 近些年消费者对羊肉的需求由吃上肉到吃好肉转变， 即由量到质的转变。 因此， 选育具 有生产高品质羊肉的品种， 提高羊肉品质是当下肉羊产业的工作热点。 [0003]羊肉品质是一个综合性状， 包含多方面的评价指标， 如肌内脂肪含量、 系水力、 嫩 度、 pH值等。 其中， 系水力是一项重要的肉质性状， 是指肌肉组织保持水分的能力。 即当肌肉 受到外力作用时， 如加 压、 切碎、 冷冻、 加热、 融冻、 加 工和贮存等， 保持原有水分的能力。 系 水力主要针对肌肉中的结合水， 其与肌原纤维蛋白质分子表 面结合， 不易解离和蒸发。 系水 力直接影响肉的滋 味、 多汁性、 嫩度、 色泽、 营养成分及香气等食用品质。 系水力高， 生肉表 现为多汁、 鲜嫩、 表 面干爽， 烹调后肉质嫩爽； 系水力低则表面水渗出， 贮藏过程中滴水损失 大， 肉成熟后肉质老韧。 我们常用滴水损失来衡量肌肉的系水力， 滴水损失大的个体系水能 力差， 滴水损失小的个 体， 系水能力优。 [0004]滴水损失是反映系水力的典型代表性指标， 当前多数研究或应用都表现在肉质评 价的过程中， 滴水损失指标在肉羊选育的早期 选择中很少涉及， 往往被忽视， 同时也没有很 好的方法用于此性状的选择。 发明内容 [0005]本发明的目的是要提供一种降低羊肉滴水损失的ATG5基因的单倍型组合的筛选 方法。 [0006]为达到上述目的， 本发明是按照以下技 术方案实施的： [0007]一种降低羊肉滴水损失的ATG5基因的单倍型组合的筛 选方法， 包括以下步骤： [0008]S1、 采集待测羊只的血 液， 提取待测羊只基因 组DNA； [0009]S2、 设计ATG5基因引物， 并使用设计的ATG5基因引物对待测羊只基因组DNA进行 PCR扩增， 获得PCR扩增产物， 然后对PCR扩增产物进行测序； [0010]S3、 将PCR扩增产物的测序结果通过DNAMAN、 Chromas软件进行比对以确定其有效 突变位点， 然后进行基因分型； [0011]S4、 根据待测羊中每个个体对应 的基因型进行遗传多样性分析， 计算基因频率及 基因型频率， 判断各个位点是否处于哈迪温伯格平衡状态， 其中： 基因频率表 示ATG5基因各 突变位点的等位基因在群体中的比例， 基因型频率表示ATG5基因各突变位点产生的不同基 因型在群 体中的比例； [0012]S5、 针对检测到的有效突变位点， 利用Haploview软件进行单倍型分析， 并对每一说　明　书 1/4 页 3 CN 114921564 A 3