(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210549786.7 (22)申请日 2022.05.20 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 郭爱珍　马耀争　胡长敏　陈颖钰　 朱杰　陈曦　陈建国　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 徐绍新 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6893(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12R 1/42(2006.01) C12R 1/90(2006.01) (54)发明名称 用于检测沙门 氏菌和隐孢子虫的多重实时 荧光定量PCR引物和探 针组合 (57)摘要 本发明公开一种多重实时荧光定量PCR引物 和探针组合， 它由两组分别针对沙门氏菌InvA 基 因、 隐孢子虫18SrRNA基因设计的引物和探针组 成， 本发明还公开了含有该引物和探针组合的试 剂盒以及检测方法。 本发明实现了沙门氏菌和隐 孢子虫的双重实时荧光定量PCR检测， 此方法快 速、 准确、 特异性和灵敏性高， 可以同时实现对沙 门氏菌和隐孢子虫的定性和准确定量检测。 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图5页 CN 114752594 A 2022.07.15 CN 114752594 A 1.一种多重实时荧光定量PCR引物和探针组合， 其特征在于由两组分别针对沙门氏菌 InvA基因、 隐孢子虫18SrRNA基因设计的引物和探针组成， 各 组引物和探针的核苷 酸序列如 下： 第一组： 上游引物序列如SED  ID NO:1所示， 下游引物序列如SEQ  ID NO:2所示， 探针序 列如SEQ ID NO:3所示； 第二组： 上游引物序列如SED  ID NO:4所示， 下游引物序列如SEQ  ID NO:5所示， 探针序 列如SEQ ID NO:6所示。 2.如权利要求1所述的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合， 其特征在于： 所述探针 的5’端连接有荧 光基团， 3 ’端连接有荧 光淬灭基团。 3.如权利要求2所述的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合， 其特征在于， 所述第一 组探针的荧光基团为FAM， 荧光淬灭基团为BHQ 1； 所述第二组探针的荧光基团为ROX， 荧光淬 灭基团为BHQ2。 4.权利要求1 ‑3任一项所述的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合在非诊断目的检 测牛病原体中的应用， 所述牛病原体是沙门氏菌和隐孢子虫。 5.权利要求1 ‑3任一项所述的多重实时荧光定量PCR引物和探针组合在制备检测牛病 原体的试剂盒中的应用， 所述牛病原体是沙门氏菌和隐孢子虫。 6.一种检测牛病原体的试剂盒， 该试剂盒包含权利要求1 ‑3任一项所述的多重实时荧 光定量PCR引物和探针组合。 7.一种非诊断目的检测牛病原体的方法， 所述牛病原体是沙门氏菌和隐孢子虫， 其特 征在于： 包括向反应体系中加入权利要求1 ‑3任一项所述的引物和探针组合并进行多重实 时荧光定量PCR扩增的步骤。 8.如权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述反应体系如下： 2 ×T5 Fast qPCR  Mix12.5 μL； 第一组上、 下游引物各1.1 μL、 探针0.9 μL； 第二组上、 下游引物各0.8 μL、 探针1.1 μL； 模板DNA  2 μL； 双蒸水补足至25 μL。 9.如权利 要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述扩增的反应程序 为： 95℃5min； 95℃ 10s， 60℃30s， 共42个 循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752594 A 2用于检测沙门氏菌和隐孢 子虫的多重 实时荧光定量PCR引物 和探针组合 技术领域 [0001]本发明属于分子检测领域， 涉及一套用于检测沙门氏菌、 隐孢子虫的引 物和探针 组合， 本发明还涉及该引物和探针组合的应用。 技术背景 [0002]沙门氏菌可引起犊牛副伤寒， 该病在国内外广泛存在， 在我国呈现逐年增加的趋 势。 目前我国青海省、 甘肃省等多地牧区都有沙门氏菌病大规模爆发的报道， 感染牛和带菌 牛都可作为该病的主要传播源， 患牛可成为沙门氏菌的长期携带者。 当牛本身的体质下降， 抵抗力减弱时， 就会发病， 带菌牛通过排尿、 排粪和流产等途径把细菌排出， 污染周边环 境。 犊牛感染沙门氏菌后， 多表现为肠炎型和中毒症状， 其体温升高并伴随着恶臭黄 色下痢， 甚 至出现黏液 血液便， 急性病例数日内即死于败血症， 给养牛业造成巨大的经济损失。 [0003]隐孢子虫(Cryptosporidium)是一类导致人和动物腹泻的寄生性原虫， 造成犊牛 腹泻的主要是微小隐孢子虫， 由其引起的隐孢子病 是一类人兽共患病。 隐孢子虫拥有广阔 的生存区域， 可影响包括人在内的约二百四十余种哺乳动物， 它们之间可经由水、 食品、 空 气等各种渠道相互传染， 隐孢子虫主要导致幼龄哺乳动物的消 化系统和呼吸道疾病， 并造 成其生产性能降低甚至死亡。 犊牛被隐孢子虫传染后， 会出现高热、 呕吐、 腹泻等临床症状， 并伴有水糊状的恶臭粪便， 而且病情反复， 造成犊牛的免疫功能出现极大的损伤， 生长困 难， 甚至出现渐进式致死性腹泻， 严重影响其 生长发育甚至 造成犊牛 死亡。 [0004]临床上经常出现多种病原体 的混合感染， 给养牛业造成很大的损失， 行之有效的 金标准是进 行病原的鉴别诊断， 这也是预防和控制感染的关键所在。 目前， 我国针对致牛混 合感染病原的多重检测的研究相对较少， 血清学检测和病原的分离鉴定是目前最为主要的 诊断手段， 但无论是病原的分离鉴定还是血清学检测方法都耗时费力， 最重要的是其都对 多种病原的混合 感染无能为力。 所以构建一个运行迅速、 简单、 灵敏度高和特异 性好的实验 室检查方案对于及早做出临床判断、 实施流行病学研究和最 终遏制其传播流行有着非常关 键的意义。 [0005]实时荧光定量PCR技术不但 可对病原菌定性， 并且还可简单、 迅速、 敏感、 精确地定 量病原菌DNA或RNA的量， 并且还能动态地研究整个病 程中潜在病原菌的复活或持续感染。 本研究以实时荧光定量PCR技术为基础， 建立了一种能够同时检测沙门氏菌和隐孢子虫 的 双重实时荧 光定量PCR方法， 以为我国临床上 牛病原体的病原学检测提供技 术支撑。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种多重实时荧光定量PCR引物和探针组合， 用于沙门氏 菌和隐孢子虫两种牛病原体的检测。 [0007]上述目的是通过以下技 术方案实现的： [0008]一种多重 实时荧光定量PC R引物和探针组合， 由两组分别针对沙门氏菌InvA基因、说　明　书 1/11 页 3 CN 114752594 A 3