(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210550770.8 (22)申请日 2022.05.20 (71)申请人 江苏宏微特斯医药 科技有限公司 地址 226499 江苏省南 通市如东县掘港街 道珠江路888号 （如东高新区生命健康 产业园） (72)发明人 冯华华　杨红雷　陶海霞　胡小许　 常沙沙　王玲娟　赵佩佩　刘利成　 (74)专利代理 机构 北京玄法律师事务所 16 002 专利代理师 潘满根 (51)Int.Cl. C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/74(2006.01) C12R 1/725(2006.01) C12R 1/72(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/43(2006.01) C12R 1/37(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 单管检测多个待测目标核酸序列方法及其 试剂盒 (57)摘要 本发明提供单管检测多个待测目标核酸序 列的方法及其试剂盒， 所述方法利用PCR扩增产 物的熔点Tm值实现， 所述方法包括： 针对每个待 测目标核酸序列设计特异性探针和下游引物， 所 述特异性探针一部分作为特异性上游引物； 退火 时， 所述探针及下游引物分别与各自待测目标核 酸序列特异性结合， 形成杂交双链， 且在所述RNA 碱基处形成DNA ‑RNA杂交链； 通过不同待测目标 核酸序列的带荧光标记的PCR产物的Tm差异和/ 或不同的荧光标记， 实现多个待测目标核酸序列 的多重检测。 本发明利用基于产物的熔解曲线检 测多靶标核酸， 控制RNA碱基5 ’端左侧序列的Tm 值和探针的Tm值在一定的范围内， 只需针对待测 序列设计探针和下游引物， 即可完成检测和扩 增， 降低扩增体系中的序列的数量， 降低不同序 列间多聚体形成， 具有高的灵敏度和特异性。 权利要求书2页 说明书7页 序列表7页 附图2页 CN 115094125 A 2022.09.23 CN 115094125 A 1.单管检测多个待测目标核酸序列的方法， 其特征在于， 所述方法利用PCR扩增产物的 熔点Tm值实现， 所述方法包括以下步骤： 步骤1： 针对每个待测目标核酸序列设计特异性探针和下游引物， 所述特异性探针一部 分作为特异 性上游引物， 控制所述特异性上游引物的Tm值在50 ‑70℃， 所述探针的Tm值范围 为60～80℃， 通过对每个待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值的控制， 使得同一荧光标 记通道内不同的待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值通过PCR仪能够区分； 所述探针含 至少1个RNA碱基， 在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5 ’端一侧的探针碱基上标记荧光基团， 在所述RNA碱基靠近所述探针3 ’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团； 在所述RNA碱基的左侧 所述探针片段 熔点Tm值高于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段 熔点Tm值； 步骤2： 退火时， 所述探针及下游引物分别与各自待测目标核酸序列特异性结合， 形成 杂交双链， 且在所述RNA碱基处形成DNA ‑RNA杂交链； 步骤3： 在耐热核糖核酸酶RN aseH工作温度下， 所述耐热核糖核酸酶RN aseH切割与待测 核酸序列结合的RNA碱基， 使得RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链， 而在所述RNA碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去； 步骤4： 在退火温度的基础上， 升高温度到达延伸温度， 在此温度下聚合酶以RNA碱基左 侧的含有荧光基团的片段作为上游引物进 行延伸， 生成待测目标核酸序列的带荧光标记的 PCR产物； 步骤5： 通过不同待测目标核酸序列的带荧光标记的PCR产物的Tm差异和/或不同的荧 光标记， 实现多个待测目标核酸序列的多重检测。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述延伸温度为高于所述退火温度5～20 ℃。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述延伸温度高于所述退火温度10～15 ℃。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 通过控制所述探针和所述下游引物之间的 序列长度实现对每个待测靶标核酸序列的Tm值控制， 使得同一荧光标记通道内不同的待测 目标核酸序列的荧 光产物熔点Tm值在荧 光PCR仪上能够区分。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述探针与 所述下游引物之间序列的长度 为10bp‑150bp， 优选地 为15bp‑130bp。 6.利用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个待测目标核酸序列的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒包括： a.针对每个待测目标核酸序列设计特异性探针和下游引物， 所述特异性探针一部分作 为特异性上游引物， 控制所述特异性上游引物的Tm值在50 ‑70℃， 所述探针的Tm值范围为60 ～80℃， 实现对每个待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值的控制， 使得同一荧光标记通 道内不同的待测目标核酸序列的荧光产 物熔点Tm值通过PCR仪能够区分； 所述探针含至少1 个RNA碱基， 在所述RNA碱基左侧 靠近所述探针5 ’端一侧的探针碱基上标记荧光基团， 在所 述RNA碱基靠近所述探针3 ’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团； 在所述RNA碱基的左侧所述 探针片段熔点Tm值高于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值； 所述下游引物及探 针分别与各自待测目标核酸序列特异性结合， 形成探针 ‑模板杂交双链， 且在所述RNA碱基 处形成DNA ‑RNA杂交链；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115094125 A 2b.耐热核糖核酸酶RNaseH， 所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割与待测核酸序列结合的 RNA碱基， 使 得RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链， 而在所述RA N碱基 右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去； c.核酸聚合酶， 在所述RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段作为引物情况下， 所述聚合 酶使得待测目标核酸序列生成带荧 光标记的PCR产物。 7.根据权利要求6所述的试剂 盒， 其特征在于， 通过控制所述探针和所述下游引物之间 的序列长度实现对每个待测靶标核酸序列的Tm值控制， 使得同一荧光标记通道内不同的待 测目标核酸序列的荧 光产物熔点Tm值在荧 光PCR仪上能够区分。 8.根据权利要求7所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述探针与所述下游引物之间序列的长 度为10bp ‑150bp， 优选地 为15bp‑130bp。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115094125 A 3