(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210549896.3 (22)申请日 2022.05.20 (66)本国优先权数据 202210360172.4 202 2.04.07 CN (71)申请人 佛山科学技术学院 地址 528000 广东省佛山市禅城区江湾一 路18号 (72)发明人 付强　夏怡　徐建琦　赵贤杰　 郭健锋　林梓华　胡俊冶　 (74)专利代理 机构 广州三环 专利商标代理有限 公司 44202 专利代理师 王建宇 (51)Int.Cl. C12N 15/53(2006.01) C12N 15/34(2006.01)C12N 15/90(2006.01) C12N 15/74(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 15/11(2006.01) A61K 39/09(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61P 31/20(2006.01) C12R 1/46(2006.01) (54)发明名称 重组链球 菌及其构建方法与应用 (57)摘要 本发明公开了一种重组链球菌及其构建方 法与应用， 涉及基因编辑技术领域。 本发明采用 同源重组技术敲除了猪败血性链球菌弱毒株 ST171的hasB基因， 降低菌株毒力， 进而以ST171Δ hasB作为细菌活载体， 把PCV3的Cap基因插入 ST171ΔhasB的Szp基因中制成重组活载体疫苗。 该疫苗毒力小， 生产成本较低， 而且能同时预防 PCV3和链球 菌的感染。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图8页 CN 115418369 A 2022.12.02 CN 115418369 A 1.用于敲除猪败血性链球菌中hasB基因的引物， 其特征在于， 其核苷酸序列如SEQ  ID  No.1～4所示。 2.用于敲除猪败血性链球菌中hasB基因的质粒的构建方法， 其特 征在于， 包括： 提取猪败血性链球菌的基因组DNA， 采用如权利要求1所述的引物扩增hasB 上下同源臂 片段； 将hasB上 下同源臂片段 连接至载体pG+host5中， 即得到pG+host5ΔhasB质粒。 3.敲除hasB基因的猪败血性链球菌的构建方法， 其特征在于， 包括采用如权利要求2所 述的构建方法所构建的质粒转染猪败血性链球菌 。 4.一种重组链球菌的构建方法， 其特 征在于， 包括： 构建敲除hasB基因的猪败血性链球菌； 构建包含有敲除hasB基因的猪败血性链球菌中Szp基因上下同源臂片段和猪圆环病毒 3型的Cap蛋白的编码序列的重组载体； 将所述重组载体转 化至所述 敲除hasB基因的猪败血性链球菌中进行同源重组。 5.如权利要求2、 3或4所述的构建方法， 其特征在于， 所述猪败血性链球菌为ST171弱毒 菌株。 6.如权利要求4所述的构建方法， 其特征在于， 所述猪圆环病毒3型的Cap蛋白的编码序 列如SEQ ID No.5所示。 7.如权利要求4所述的构建方法， 其特征在于， 所述构建包含有敲除h asB基因的猪败血 性链球菌中S zp基因上下同源臂片段和猪圆环病毒3型的Cap蛋白的编码序列的重组载体的 步骤包括： 提供/提取猪圆环病毒3型的基因组DNA， 采用核苷酸序列如SEQ  ID No.6～7的引物扩 增Cap片段； 提取猪败血性链球菌的基因组DNA， 采用核苷酸序列如SEQ  ID No.8～11所示的引物扩 增Szp上下同源臂片段； 将Cap片段和Szp上下同源臂片段连接至载体pG+host5中， 得到pG+host5‑SzP‑Cap重组 载体。 8.如权利要求7所述的构建方法， 其特征在于， 所述将所述重组载体转化至所述敲除 hasB基因的猪败血性链球菌中进行同源重组的步骤 包括： 将pG+host5‑SzP‑Cap重组载体电转入敲除hasB基因的猪败血性链球菌中进行同源重 组； 通过温度和抗 性筛选得到ST171ΔhasB‑Cap/PCV3 重组链球菌； 采用核苷酸序列如SEQ  ID No.12～13的引物进行鉴定 。 9.重组链球菌， 其特 征在于， 其由如权利要求 4～8任一项所述的构建方法构建。 10.质粒， 其特 征在于， 其由如权利要求2或4所述的构建方法构建。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115418369 A 2重组链球菌及其构建 方法与应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因编辑 技术领域， 尤其涉及一种重组链球菌及其构建方法与应用。 背景技术 [0002]猪圆环病毒 Ⅲ型(Porcinecircovirus  3， PCV3)是圆环病毒科圆环病毒属的一种 无囊膜、 共价闭环单股负链DNA病毒(ssDNA)， 是 目前为止发现的所有动物病毒中最小的之 一。 2016年前， 全球范围内仅发现PCV1和PCV2两个基因型。 其中， PCV1被认为是猪肾细胞PK ‑ 15污染物， 但 不产生细胞病变效应， 对猪无致病性。 PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征 (PMWS)主要病原， 与猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、 猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、 繁殖障碍、 增生性坏死性肺炎(PNP)和肠炎等疾病密切相关， 均为猪圆环病毒相关疾病  (PCVAD)。 2015 年6月， 美国北卡罗来纳州某商品化猪场暴发PDNS疫情， 与历史平均值相比， 该猪场母猪死 亡率升高10.2％、 受孕率下降0.6％。 患病母猪厌食、 皮肤呈现多灶性丘疹、 斑点和浅表 性皮 炎， 所产胎儿(包括弱胎、 死胎、 木乃伊胎)具有相似临床症状。 Palinski等借助新一代测序 (NGS)技术， 从患病母猪及流产胎儿体内首次鉴定出一种新病毒， 该病毒与圆环病毒 科病毒 具有类似基因组结构和遗传相似性， 但与其他圆环病毒衣壳蛋白氨基酸序列同源性低于 70％， 根据国际病毒分类委员会(ICTV)圆环病毒分类标准， 将其归类为一种新型圆环病毒， 命名为PCV3。 2017年， 我国首次报道检测出PCV3， 华中农业大学对采自我国11个省市35个猪 场的222个样本进行了PCV3的检测， PCV3感染猪场阳性率高达68.6％(24/35)， 说明现PCV3 已普遍存在我国猪场。 [0003]PCV3基因全长为2000bp， 含有3个主要开放阅读框(ORF)， ORF1编码病毒复制相关 蛋白(Rep)， 含有279个氨基酸(aa)， ORF2编码由214个aa  组成衣壳蛋白Cap， ORF3编码是一 个由231个aa组成的功能未知蛋白质。 Cap  蛋白是病毒的免疫保护性抗原， 宿 主细胞含有与 其结合的受体， 与病毒的感染密切相关， 含有病毒诱导机体产生特异性免疫应答的主要抗 原表位。 PCV2与  PCV3 Cap蛋白aa同源性仅为30％， 两者间存在交叉免疫保护可能性较低。 因此， 该蛋白是研制PCV3相关疫苗的焦点和检测PCV3特异性免疫反应的血清学诊断方法的 靶抗原。 [0004]现已证实， PCV3对不同品种不同阶段的猪都具有易感性， 但对断乳仔猪易感性较 高， 并表现出明显的临床症状。 P CV3感染可导致免疫抵抗力下降和免疫抑制， 猪只机体难以 产生和维持对其他病原体的免疫抗体， 从而继发其他疾病。 研究揭示了多种与PCV3感染猪 群相关的并发感染病原体， 猪链球菌就是其中之一。 目前PCV3已在世界范围内广泛流行。 PCV3并非一种新 发病， 在很早以前就已存在， 由于其临床症状与PCV2相似， 并且与PCV2混合 感染率较高， 人们忽视了它的存在， 且PCV3与PCV2Cap蛋白差异较大， 现有的  PCV2疫苗对 PCV3不产生交叉性免疫， 目前尚没有有效的疫苗预防P CV3。 因此， 高效廉价的疫苗研发成为 必要， 增强免疫效果和降低经济损失。 [0005]猪链球菌病是由多种致病性链球菌感染引起的一种人兽共患病， 有重要的公共卫 生意义， 同时也是当今危害养猪业最重要的细菌性疾病之一。 猪链球菌菌体的细胞壁外包说　明　书 1/8 页 3 CN 115418369 A 3