(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210544494.4 (22)申请日 2022.05.18 (71)申请人 中南林业科技大 学 地址 410004 湖南省长 沙市韶山 南路498号 (72)发明人 李旺　苏志鹏　任佳丽　 (74)专利代理 机构 长沙心智力知识产权代理事 务所(普通 合伙) 4323 3 专利代理师 张洪敏 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/682(2018.01) C12N 15/115(2010.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 邻近碱基对增强型脱氧核酶和生物传感及 生物传感器的应用 (57)摘要 本发明公开了一种邻近碱基对增强型脱氧 核酶和生物传感器及生物传感器的应用， 增强型 脱氧核酶的核苷酸序列G4 ‑AA、 G4‑AG、 G4‑A‑MdA、 G4‑A‑AP、 G4‑A‑dI中的一种； 生物传感器包括增 强型脱氧核酶、 互补DNA链、 大肠杆菌适配体和氯 铁血红素。 本发明通过改变G4邻近两位的碱基并 根据沃森 ‑克里克碱基互补配对原则与邻近第二 位杂交互补， 进而增强DNAzyme的活性。 基于增强 型脱氧核酶的生物传感器， 能特异性检测大肠杆 菌， 具有较高的检测灵敏度和回收率。 权利要求书1页 说明书10页 序列表1页 附图5页 CN 114703192 A 2022.07.05 CN 114703192 A 1.一种邻近碱基对增强型脱氧核酶， 其特征在于， 所述增强型脱氧核酶的核苷酸序列 G4‑AA、 G4‑AG、 G4‑A‑MdA、 G4‑A‑AP、 G4‑A‑dI中的一种； 所述G4‑AA的核苷酸序列为： G4 ‑AA‑TTTCGCTATGTCTG； 所述G4‑AG的核苷酸序列为： G4 ‑AG‑TTTCGCTATGTCTG； 其中G4‑A‑MdA的核苷酸序列为： G4 ‑A‑/6‑med a/‑TTTCGCTATGTCTG； G4‑A‑AP的核苷酸序列G4 ‑A‑/i2‑amp/‑TTTCGCTATGTCTG； G4‑A‑dI的核苷酸序列G4 ‑A‑/6‑ide oxy i/‑TTTCGCTATGTCTG。 2.根据权利要求1所述的邻 近碱基对增强型脱氧核酶， 其特征在于， 所述G4的核苷酸序 列如SEQ ID NO.1所示。 3.一种生物传感器， 其特征在于， 包括权利要求1或2所述的邻近碱基对增强型脱氧核 酶、 互补DNA 链、 大肠杆菌适配 体和氯铁血红素。 4.根据权利要求3所述的生物传感器， 其特 征在于， 所述互补DNA 链为cDNA， cDNA的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 5.根据权利要求3所述的生物传感器， 其特征在于， 所述大肠杆菌适配体的核苷酸序列 如SEQ ID NO.2所示。 6.根据权利要求3至5种任一项所述的生物传感器， 其特征在于， 所述生物传感器还包 MES缓冲液体系 、 ABTS2‑和H2O2。 7.根据权利要求6所述的生物传感器， 其特征在于， 所述增强型脱氧核酶的浓度为 200nM： 所述互补DNA链的浓度 为400nM， 所述氯铁血红素的浓度 为200nM； 所述ABTS2‑的浓度 为1mM； 所述H2O2的浓度为2mM 。 8.一种权利要求3 至7中任一项所述 生物传感器在检测大肠杆菌中的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特 征在于， 所述应用的方法为： (1)取待测液体添加到含有大肠杆菌适配 体的MES缓冲液中孵化得到体系一； (2)往所述体系一中加入权利要求1或2所述的邻近碱基对增强型脱氧核酶、 氯铁血红 素和互补DNA 链孵化， 得到体系二； (3)将所述体系二 转入石英比色皿中， 加入H2O2和ABTS2‑， 摇匀得到体系三； (4)紫外分光 光度计测取体系三的420nm处吸光度变化 值。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703192 A 2邻近碱基对增强型脱氧核酶和生物传感 及生物传感器的应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物技术领域， 具体涉及一种邻近碱基对增强型脱氧核酶和生物传感 及生物传感器的应用。 背景技术 [0002]大肠杆菌是一种常见的食源性病原体， 可导致人体出现溶血性尿毒症综合征、 出 血性结肠炎、 急性肾损伤甚至死亡等现象。 食源性大肠杆菌暴发与食用受污染的食物有关， 例如新鲜蔬菜、 酸性饮料和碎牛肉。 因此， 对食品中大肠杆菌检测是食品安全检测中的重要 一环。 传统检测大肠杆菌的方法以微生物培养为代表， 尽管能依据形态特征、 生长特性等特 异性鉴别菌种， 但是操作过程繁琐， 耗时较长， 一般情况下检测时间需要数天， 且容易被空 气中的微生物污染。 随着科研人员对微生物检测的关注， 仪器分析、 分子生物学、 以及 免疫 学等技术在微生物检测中的应用出现大家的视野里， 在一定程度上解决了传统微生物检测 方法的耗时长、 容易污染等问题， 但是以上方法存在操作复杂、 成本较高、 特异性低以及灵 敏度低等不 足， 导致检测结果不稳定。 因此， 开 发一种经济实惠、 简单快速、 灵敏度较高的检 测方式尤为重要。 目前， 生物传感器因检测速度快、 经济实惠等优势被大家所熟知， 但是现 有方法存在灵敏度低， 检测背景高等 不足。 [0003]为了提高生物传感器在检测过程中的灵敏度， 通常会加入具有催化功能的酶， 加 速氧化还原反应， 将生化反应转化为荧光、 比色、 电化学信号。 传统上用于催化的酶大部分 为蛋白质酶， 如常用于生物传感领域的辣根过氧化物酶， 尽管其具有较高的催 化活性， 但存 在保存要求高、 酶活不稳定等缺点。 然而， 类似辣根过氧化物酶催化活性的脱氧核酶 (DNAzyme， 由富含G(鸟嘌 呤)的DNA单链和hemin组成)具有体积较小， 容易合 成等优势， 有望 取代辣根过氧化物酶在生物传感中的位置。 但是， 在实际应用中发现脱氧核酶的活性并不 高， 达不到辣根过氧化物酶的活性。 以往为了增强脱 氧核酶的活性会通过序列筛选、 修饰 G4 骨架、 添加活性激活剂， 添加侧翼序列等方式筛选高催化活性的脱氧核酶， 这些方式为提高 脱氧核酶活性提供了具有参考意义的思路， 即使如此， 脱氧核酶活性倍数远不及辣根过氧 化物酶。 因此， 如何提高脱氧核酶活性是生物传感应用于检测中必须要考虑的重要因素之 一。 发明内容 [0004]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足， 提供一种邻近碱基对增强型脱 氧核酶， 并基于该脱氧核酶构建检测大肠杆菌的生物传感器， 最终应用于大肠杆菌检测。 [0005]为了实现上述目的， 本发明提供了一种邻近碱基对增强型脱氧核酶， 所述增强型 脱氧核酶的核苷酸序列G4 ‑AA、 G4‑AG、 G4‑A‑MdA、 G4‑A‑AP、 G4‑A‑dI中的一种； [0006]所述G4‑AA的核苷酸序列为： G4 ‑AA‑TTTCGCTATGTCTG； [0007]所述G4‑AG的核苷酸序列为： G4 ‑AG‑TTTCGCTATGTCTG； [0008]所述G4‑A‑MdA的核苷 酸序列为： G4 ‑A‑/6‑med a/‑TTTCGCTATGTCTG； (/6 ‑med a/为说　明　书 1/10 页 3 CN 114703192 A 3