(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210539145.3 (22)申请日 2022.05.18 (71)申请人 南京农业大 学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 陈素梅　李菲　甘好　张一　 王新慧　蒋甲福　周李杰　王利凯　 陈发棣　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 刘杨 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C12N 15/84(2006.01) C12N 15/64(2006.01) A01H 5/00(2018.01)A01H 6/14(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种提高菊花抗蚜性的基因CmMYB15-like 的植物表达载体及应用 (57)摘要 本发明公开了一种提高菊花抗蚜性的基因 CmMYB15‑like、 植物表 达载体及其构建方法和应 用。 其中， 该基因具有如SEQ  ID NO： 1所示的序 列， 其通过上调4 ‑香豆酸辅酶A连接酶的基因表 达水平， 调控木质素合成从而增加细胞壁厚度， 提高菊花抗蚜性。 同时， 以该基因构建了相应的 植物表达载体； 所述基因及其植物表达载体可用 于培育抗蚜转基因植物， 具体以菊花 ‘神马’为材 料获得抗蚜 性基因CmMYB15 ‑like， 构建其植物表 达载体， 通过农杆菌介导法导入菊花 ‘神马’。 对 转基因植株及野生型进行蚜虫接种处理， 表明转 基因植株的抗蚜性明显增强， 为菊花抗蚜性工程 育种提供优异基因储备和新的策略。 权利要求书2页 说明书7页 序列表3页 附图6页 CN 114875041 A 2022.08.09 CN 114875041 A 1.一种提高菊花抗蚜性 的基因CmMYB15 ‑like， 其特征在于， 所述基因CmMYB15 ‑like的 序列如SEQ  ID No： 1所示。 2.根据权利要求1所述的基 因CmMYB15 ‑like， 其特征在于， 所述基因CmMYB15 ‑like来源 于菊花‘神马’的SG2 R2R3MYB家族基因。 3.一种权利要求1或2所述的基因CmMYB15 ‑like的构建方法， 其特征在于， 包含以下步 骤： (1)将基因Cm4CL2启动子区的顺式作用元件ACCTACC、 ACCAACC分别串联重复构建序列 如SEQ ID No： 2、 SEQ  ID No： 3所示的MYB转录因子结合元件AC ‑I、 AC‑II， 然后构建至pHIS2 载体， 筛选菊花酵母单杂交文库； (2)参考AC ‑I、 AC‑II设计获得AC突变作用元件AAATATT， 将AC突变作用元件串联重复构 建序列如SEQ  ID No： 4所示的突变结合元件mAC， 然后构建pHIS2载体作为阴性对照。 4.一种提高菊花抗蚜性的基因CmMYB15 ‑like的植物表达载体， 其特征在于， 含有权利 要求1～2任一所述的基因CmM YB15‑like。 5.一种提高菊花抗蚜性的基因CmMYB15 ‑like的植物表达载体的构建方法， 其特征在 于， 包含以下步骤： (1)菊花CmM YB15‑like基因的克隆 以菊花‘神马’材料的cDNA为模板， 根据CmMYB15 ‑like基因序列信息设计开放阅读框特 异性引物CmMYB15 ‑like‑F和CmMYB15 ‑like‑R， 进行PCR反应， 产物与pMD19 ‑T载体进行连接， 转化DH5α 感受态细胞， 克隆获得序列为SEQ  ID NO： 1的菊花CmM YB15‑like基因； 基因克隆引物： CmMYB15‑like‑F： ATGGGGAGAGCAC CTTGTTG， CmMYB15‑like‑R： TTAAAACTCAGGTAACTCGG； (2)入门载体pENTRYTM1A‑CmMYB15‑like的构建 以包含CmMYB15 ‑like基因序列的pMD19 ‑T‑CmMYB15‑like质粒为模板， 上下游 分别引入 含有BamH  I和Xho I而不含有pENTRYTM1A载体的CmMYB15 ‑like基因酶切位点， 设计引物 CmMYB15‑like‑GATE‑F和CmMYB15 ‑like‑GATE‑R， 进行PCR反应， 将产物与pENTRYTM1A载体分 别由BamH I和Xho I双酶切并连接， 构建入门载体pENTRYTM1A‑CmMYB15‑like； 入门载体构建引物： CmMYB15‑like‑GATE‑F： CGGGATCCGGATGGGGAGAGCAC CT， CmMYB15‑like‑GATE‑R： CCGCTCGAGTGA AACTCAGGTAACTC； (3)植物表达载体pMDC43 ‑CmMYB15‑like的构建 将入门载体pENTRYTM1A‑CmMYB15‑like阳性质粒经Pvu  I单酶切线性化后与pMD C43质粒 进行LR重组反应， 构建提高菊花抗蚜性的基因CmMYB15 ‑like的植物表达载体pMDC43 ‑ CmMYB15‑like。 6.一种权利 要求1～2任一所述的提 高菊花抗蚜性的基因CmMYB15 ‑like或权利要求4所 述的提高菊花抗蚜性的基因CmMYB15 ‑like的植物表达载体在培育抗蚜转基因植物 中的应 用。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 以菊花 ‘神马’为材料获得抗蚜性基因 CmMYB15‑like， 构建植物 表达载体， 通过农杆菌介导法导入菊花 ‘神马’。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114875041 A 28.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 以植物表达载体pMDC43 ‑CmMYB15‑like转 化EHA105农杆菌感受态细胞， 通过农杆菌介导的叶盘侵染法转化菊花 ‘神马’， 经潮霉素抗 性筛选得到阳性 转化植株。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述阳性转化植株的鉴定方法包含PCR检 测验证， 所述PCR检测验证的方法为提取潮霉素抗性筛选所得的阳性转化植株叶片及野生 型植株叶片的基因组DNA， 根据CmMYB15 ‑like基因序列设计特异性正向鉴定引物CmMYB15 ‑ like‑text‑F， 根据pMDC43载体序列设计特异性反 向鉴定引物pMDC43 ‑text‑R， 分别以提取 的DNA作为模板进 行PCR扩增， 扩增出长度为743bp的片段， 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测 分析， 所述的引物序列如下： 正向鉴定引物CmM YB15‑like‑text‑F： CGACCAGATATCA AAAGA， 反向鉴定引物pMDC43 ‑text‑R： ACGATCG GGGAAATTCGA。 10.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述阳性转化植株的鉴定方法包含qRT ‑ PCR检测验证， 所述qRT ‑PCR检测验证的方法为提取阳性转化植株及野生型植株叶片 的总 RNA， 反转录成第一链cDNA， 建立qRT ‑PCR扩增体系， 检测阳性转化植株CmMYB15 ‑like基因和 野生型植株CmEF1α 基因的表达量， 以野生型植株CmEF1α 基因的表达量为基准值， 计算阳性 转化植株CmMYB15‑like基因的相对表达值； 其中， 设计CmMYB15 ‑like基因特异性引物， 扩增出长度为92bp的片段， 检测目的基因的 表达量， 所述引物序列为： 上游引物CmM YB15‑like‑RT‑F： GAACCAATAGTTTCGCAATG， 下游引物CmM YB15‑like‑RT‑R： GACTCGCTAGACGATG GTTG。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114875041 A 3