(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210531129.X (22)申请日 2022.05.16 (66)本国优先权数据 202210495738.4 202 2.05.09 CN (71)申请人 珠海圣美生物诊断技 术有限公司 地址 519000 广东省珠海市香洲区同昌路 266号3栋3层 (72)发明人 黄萌　叶莘　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 刘桐亚 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6811(2018.01) C12Q 1/6841(2018.01) (54)发明名称 随机探针、 制备方法及应用 (57)摘要 本发明涉及分子生物学技术领域， 尤其是涉 及随机探针、 制备方法及应用。 本发明提供了一 种随机探针、 制备方法及应用， 所述制备方法使 用转座酶对靶标序列随机片段化， 片段化的过程 中， 在得到的随机靶 标片段两端添加转座酶识别 序列， 而后以得到的随机靶标片段为扩增模板， 以靶向转座酶识别序列的序列为扩增引物， 在 dUTP与dTTP+dUTP数量比为50％～100％的扩增 体系中进行扩增， 得到靶向靶标序列的随机探 针。 采用该方法制备得到的随机探针中均匀含有 能够作为标记位点的碱基U， 因此， 采用本发明提 供的制备方法得到的随机探针， 能够实现全序列 范围内的标记， 用于检测时能够表现出更加优异 的灵敏度和准确度。 权利要求书2页 说明书16页 序列表5页 附图2页 CN 114891787 A 2022.08.12 CN 114891787 A 1.随机探针的制备方法， 其特征在于， 使用转座酶对靶标序列随机片段化， 同时在得到 的随机靶标片段两端添加 转座酶识别序列， 而后以随机靶标片段为扩增模板， 以靶向转座 酶识别序列的序列为扩增引物， 在dUTP与dTTP+dUTP数量比为50％～100％的扩增体系中进 行扩增， 得到靶向靶标序列的随机 探针。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述转座酶选自Tn1、 Tn2、 Tn3、 Tn4、 Tn5、 Tn6、 Tn7、 Tn9、 Tn10、 Tn551、 Tn971、 Tn916、 Tn1545、 Tn1681、 Tgf2、 Tol2、 MuA、 Himar1或 HARBI1， 所述 转座酶识别序列包括 转座酶的ME序列。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述转座酶为Tn5， 所述转座酶Tn5的 ME序列为5 ’ ‑AGATGTGTATA AGAGACAG ‑3’。 4.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 扩增使用的DNA聚合酶选自Taq  DNA聚 合酶， Tth  DNA聚合酶， Tfl  DNA聚合酶、 TLI  DNA聚合酶、 Tne  DNA聚合酶、 Tma  DNA聚合酶、 ventTMDNA聚合酶、 Phusi onTMDNA聚合酶、 Pfu  DNA聚合酶 或KOD DNA聚合酶中的一种或多种。 5.根据权利要求1～4任一项所述的制备方法， 其特征在于， 所述随机探针中的dUTP还 带有标记； 标记方法包括： 将dUTP标记后再加入扩增体系中， 随扩增反应进行实现对随机探针中dUTP的标记； 或 者， 扩增反应过程中或扩增完成后， 对得到的随机 探针中的dU TP进行标记。 6.根据权利要求5所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述标记为 荧光基团标记； 所述荧光基团选自荧 光素类染料、 罗丹明类染料或菁染料。 7.根据权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， dUTP的标记方法包括， dUTP与荧光基 团的活性基团直接偶联， 或者， 通过修饰 基团连接dU TP和荧光基团的活性基团； 所述修饰基团包括第一 修饰基团或第二 修饰基团； 所述第一修饰基团为氨基， 与第一修饰基团连接的第一活性基团包括异硫氰酸酯、 活 性酯、 活性 羧酸或磺酰氯化物； 所述第二修饰基团为生物素， 与第 二修饰基团连接的荧光基团包括链霉亲和素修饰的 染料， 或者， 辣 根过氧化物酶 ‑链霉亲和素偶联物。 8.根据权利要求1～4任一项所述的制备方法， 其特征在于， 在靶标序列片段化之后， 扩 增反应之前， 还 包括补全缺口序列反应步骤； 或者， 在靶标序列片段化之后的扩增反应步骤中， 首先经过以补全缺口序列为目的的延伸程 序， 而后再调整参数进行扩增。 9.根据权利要求1～4任一项所述的制备方法， 其特征在于， 所述转座酶识别序列包括 转座酶的ME序列和连于转 座酶的ME序列5’端的接头序列； 所述接头序列中碱基A的数量 为1～20； 所述接头序列包括TCGTCGGCAGCGTC、 ACGATGTCAGCGAC、 或AAGAGACCACCAGAGTAGCAACGA TGTCAGCGAC 。 10.采用权利要求1～ 9任一项所述制备 方法制备 得到的随机 探针。 11.根据权利要求10所述的随机探针， 其特征在于， 所述随机探针的长度为100～ 500bps， 所述随机 探针中每10 0个核苷酸含有标记的数量 为3～10个。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114891787 A 212.权利要求10或1 1所述随机 探针在核酸杂交测定中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114891787 A 3