(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210520268.2 (22)申请日 2022.05.12 (71)申请人 四川大学 地址 610065 四川省成 都市武侯区一环路 南一段24号 (72)发明人 王刚　谢丽芳　卢宛翎　邓璐　 张嫣菡　 (74)专利代理 机构 成都禾创知家知识产权代理 有限公司 51284 专利代理师 裴娟 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 15/85(2006.01)A61K 38/28(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 3/10(2006.01) (54)发明名称 一种肌源性细胞血糖 响应型表达SIA的启动 子、 重组载体及其构建方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种肌源性细胞血糖响应型 表达SIA的启 动子、 重组载体及其构建方法和应 用， 属于生物医药技术领域， 本发明使用血糖响 应型肌肉特异性启动子pGREMS调控SIA的表达， 实现了高活性单链胰岛素类似物SIA3， SIA4， SIA7在骨骼肌部位特异性高效表达并分泌至血 液中， 可以达到有效降血糖的效果。 同时由于设 计筛选的启动子具有血糖响应性功能可以在血 糖较低时关闭胰岛素表达， 避免因胰岛素过量表 达产生的低血糖副作用。 本发明提供的重组表达 载体可应用于制备治疗糖尿病药物中， 尤其适用 于I型糖尿病， 且提供的重组表达载体构建方法 简单、 操作方便， 适用于 工业化大规模生产。 权利要求书1页 说明书7页 序列表23页 附图7页 CN 114807140 A 2022.07.29 CN 114807140 A 1.一种肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子， 其特征在于， 所述肌源性细胞血糖响 应型表达SIA的启动子为pGRE MS， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 2.制备如权利要求1所述肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子的引物， 其特征在 于， 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所 示。 3.一种重组载体， 其特征在于， 包含权利要求1所述的肌源性细胞血糖响应型表达SIA 的启动子 。 4.一种重组载体的构建方法， 其特 征在于， 它包括以下步骤： S1. 扩增CRE片段： 从质粒pCRE ‑SEAP上扩增CRE片段， 质粒pCRE ‑SEAP的核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示； S2. 扩增CRE‑EMS片段： 以pEMS ‑SIA3‑his为模板扩增C RE‑EMS片段， 质粒pEMS ‑SIA‑his 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5； S3. 扩增pGRE MS片段： 以CRE片段与CRE ‑EMS片段为模板， 扩增pGRE MS片段； S4. 构建载体： 将质粒pSC ‑SIA‑his进行MluI和BamHI双酶切， 去除sv40  enhancer ‑CMV 片段的部分与扩增后的pGRE MS片段进行 连接， 构建pGRE MS‑SIA‑his载体。 5.根据权利要求4所述的一种重组载体的构建方法， 其特征在于， 所述质粒pSC ‑SIA‑ his为pSC ‑SIA3‑his、 质粒pSC ‑SIA4‑his和质粒pSC ‑SIA7‑his， 构建的载体分别为pGREMS ‑ SIA3‑his， pGRE MS‑SIA4‑his， pGRE MS‑SIA7‑his载体； 其中， 所述质粒pSC ‑SIA3‑his的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示， 质粒pSC ‑SIA4‑his的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示， 质粒pSC ‑SIA7‑his的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示； 载 体pGREMS ‑SIA3‑his的核苷酸序列如SEQ  ID NO.9所示， 载体pGREMS ‑SIA4‑his的核苷酸序 列如SEQ ID NO.10所示， 载体pGRE MS‑SIA7‑his的核苷酸序列如SEQ  ID NO.11所示。 6.根据权利要求4所述的一种重组载体的构建方法， 其特征在于， 所述扩增CRE片段的 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.12所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.13所 示。 7.根据权利要求4所述的一种重组载体的构建方法， 其特征在于， 所述扩增CRE ‑EMS片 段的上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.14所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.15 所示。 8.权利要求3所述的重组载体， 权利要求4 ‑7中任一所述的方法构建的pGREMS ‑SIA‑his 载体在制备治疗糖尿病药物中的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特 征在于， 所述的糖尿病为 Ⅰ型糖尿病。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807140 A 2一种肌源性 细胞血糖响应型表达S IA的启动子、 重组载体及其 构建方法和应用 技术领域 [0001]本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及一种肌源性细胞血糖响应型表达SIA的 启动子、 重组载体及其构建方法和应用。 背景技术 [0002]胰岛素分泌不足是糖尿病的核心发病原因， Ⅰ型糖尿病(T1D)的治疗需要终生使用 外源性胰岛素。 在过去的100年中， 胰岛素治疗的发展取得了很大进展， 开发了新的胰岛素 制剂与递送方法包括新的胰岛素和胰岛素类似物、 不带和带传感器的连续皮下胰岛素输 注、 预测低血糖悬浮功能以及根据患者连续血糖监测读数持续自动调节的闭环系统。 这些 技术的发展扩大了产品范围， 给临床医生以实现严格的血糖控制的可能。 [0003]T1D的治疗主要是每日多次注射短效或者长效的胰岛素， 或使用胰岛素泵持续皮 下胰岛素输注。 然而， 即使每天频繁的血糖 自我监控与胰岛素注射仍旧难以精准将血糖水 平维持在正常范围内。 急性的高血糖可能引起糖尿病酮症酸中毒或高渗性非酮症昏迷， 严 重时会危及生命； 长期的高血糖会导致大血管、 微血管和神经病变等一系列并发症。 而胰岛 素过量可引起低血糖， 甚至会导 致休克、 癫痫甚至死 亡。 [0004]因此下一代胰岛素治疗的选择可能是 “智能”(葡萄糖反应性)胰岛素， 它能根据内 源性葡萄糖感应反馈机制提供胰岛素。 这样的系统将 像内源性胰腺β 细胞一样， 提供与患者 血糖状态成比例的胰岛素作用。 [0005]近年来兴起的合成生物学为 “智能(葡萄糖反应性)胰岛素 ”的治疗提供了新的思 路。 目前基于合 成生物学的胰岛素释放刺激， 包括代谢产物控制例如葡萄糖， 天然化学物质 控制合成基因网络(例如， 齐墩果酸， 茶多酚)， 获许可药物控制基因电路， 外部物理信号调 节的基因电路(如光， 电)， 或电子 设备控制的遗传电路(如智能手机)等等。 但是转化为 实际 应用还有待解决一些问题： 目前研究所采用的主要 是人源细胞HEK ‑293， 但对于临床转化来 说， 将系统整合至病 人的原代细胞中才会更加 安全。 并且细胞植入体内采取 的微胶囊包裹 技术， 细胞生命周期上较短不能达 到长期的治疗效果。 [0006]因此， 目前有必要探究一种智能、 便捷、 安全、 低成本的T1D治疗方法， 设计一套体 内胰岛素类似物的智能表达调控系统。 使得在骨骼肌中胰岛素类似物SIA的产生能够根据 体内血糖浓度高低自行启动与关闭， 即： 血糖浓度高， SIA产生系统启动； 血糖浓度低， SIA产 生系统关闭， 在T1D患者体内实现胰岛素类似物的血糖响应性表达 。 发明内容 [0007]本发明的目的在于克服现有技术的缺点， 提供一种肌源性细胞血糖响应型表达 SIA的启动子、 重组载体及其构建方法和应用， 所述重组表达体在骨骼肌部位特异 性高效表 达， 且可以响应血糖以血糖依赖形式表达SIA达 到有效降低血糖作用。 [0008]本发明的目的通过以下技术方案来实现： 一种肌源性细胞血糖响应型表达SIA的说　明　书 1/7 页 3 CN 114807140 A 3