ICS 65.020.30 CCS B 41 云 53 南 省 地 方 标 准 DB53/T 1058—2021 滇金丝猴个体识别分子技术规程 Regulation of molecular techniques of individual identification for Rhinopithecus bieti 2021 - 09 - 30 发布 云南省市场监督管理局 2021 - 10 - 14 实施 发 布 DB53/T 1058—2021 目  次 前言................................................................................................................................................................... III 1 范围................................................................................................................................................................. 1 2 规范性引用文件............................................................................................................................................. 1 3 术语和定义..................................................................................................................................................... 1 4 原理................................................................................................................................................................. 2 5 操作程序......................................................................................................................................................... 2 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 6 样品制备及 DNA 提取............................................................................................................................. 2 DNA 质量检测.......................................................................................................................................... 2 DNA 保存.................................................................................................................................................. 2 微卫星标记............................................................................................................................................. 2 微卫星标记 PCR...................................................................................................................................... 2 微卫星基因分型..................................................................................................................................... 3 个体识别......................................................................................................................................................... 3 附录 A （规范性） 滇金丝猴个体识别微卫星标记信息表....................................................................... 4 附录 B （规范性） 主要试剂及仪器设备................................................................................................... 5 附录 C （规范性） 脱氧核糖核酸样品（DNA）样品的提取..................................................................... 7 附录 D （规范性） PCR 反应......................................................................................................................... 9 I DB53/T 1058—2021 前  言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由云南省林业与草原局、云南省市场监督管理局共同提出。 本文件由云南省林业标准化技术委员会（YNTC02）归口。 本文件主要起草单位：云南大学、云南省标准化研究院。 本文件主要起草人：于黎、黄艳梅、李依恬、朱勋程、徐志茹、李迅、胡靖扬、吴宏、匡卫民。 III DB53/T 1058—2021 滇金丝猴个体识别分子技术规程 1 范围 本文件规定了滇金丝猴（Rhinopithecus bieti）个体识别分子技术的原理、操作程序、个体识别。 本文件适用于滇金丝猴个体识别、遗传多样性评估、群体历史评估和遗传档案建立。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 微卫星标记 microsatellite marker 基因组中的简单串联重复脱氧核糖核酸（DNA）片段，含短串联重复序列（Short tandem repeats， STR）和简单重复序列（Simple sequence repeats， SSR）。在个体间重复次数发生变化的多态性微卫星 位点，可以作为微卫星标记使用。 3.2 微卫星序列 microsatellite sequence 基因组中由1～6个核苷酸为基本重复单元组成的DNA串联重复序列，也称为短串联重复序列或简 单重复序列。 3.3 脱氧核糖核酸样品 DNA samples 利用滇金丝猴组织（如毛发、血液、肌肉组织等）或新鲜粪便提取的滇金丝猴基因组脱氧核糖核酸 （DNA）样品。 3.4 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction（PCR） 以一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA 聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。 3.5 微卫星基因分型 microsatellite genotyping 对样品进行微卫星位点PCR扩增后，利用自动化毛细血管电泳技术测定个体基因型。 3.6 微卫星个体识别 microsatellite individual identification 1 DB53/T 1058—2021 采用微卫星多态性技术，判断前后两次或多次出现的生物学检材是否属于同一个体。采用微卫星多 态性技术进行个体识别，以确认个体身份。 3.7 微卫星特异性引物 microsatellite specific primers 用于滇金丝猴微卫星分子鉴定选用的一套微卫星引物，具有多态性、稳定性和重复性。 4 原理 微卫星广泛分布于动物基因组的不同位置，微卫星位点具有高度的遗传多态性，微卫星标记具有高 度的物种特异性和良好的扩增重现性，是动物个体识别的首选标记。在检验过程中，可将不同的样品作 为待检样品，待检样品之间的基因型差异作为判定不同个体的依据。本文件用了10对高多态性的微卫星 标记，用于滇金丝猴个体识别（见附录A）。 5 操作程序 样品制备及 DNA 提取 5.1 收集滇金丝猴的血液、肌肉、皮肤、毛发、粪便等样品，样品采集应符合实验动物的福利和伦理的 相关要求。使用针对不同样品形式对应的专用商品试剂盒或传统分子生物学技术手段进行DNA提取。 主要试剂、仪器设备见附录B，样品的DNA提取具体步骤见附录C。 DNA 质量检测 5.2 使用微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳对每个DNA样品进行浓度分析，260/280在1.7～2.1之间， 浓度超过40 ng/µL的DNA样品合格。琼脂糖凝胶电泳检测及成像方法见附录C。 DNA 保存