ICS 65.020.30 B 41 DB12 天 津 市 地 方 标 准 DB12/T 1019—2020 猪德尔塔冠状病毒 RT-PCR 检测方法 RT- PCR assay for detection of porcine deltacoronavirus 2020 - 12 - 28 发布 天津市市场监督管理委员会 2021 - 02 - 01 实施 发 布 DB12/T 1019—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。 本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位：天津市畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：李秀丽、鄢明华、郑丽、路超、田向学、张莉、李富强、江珊、任卫科、董志 民。 I DB12/T 1019—2020 猪德尔塔冠状病毒 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）RT-PCR检测方法的原理、 仪器设备与试剂、样品对照、方法步骤和结果判定等技术内容。 本标准适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中PDCoV核酸的检测。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PDCoV：猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacoronavirus） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction） RNA：核糖核酸（ribonucleic acid） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementary DNA） PK-15细胞：猪肾细胞（porcine kidney cell） DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） Taq酶：Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus） PBS：磷酸缓冲液（phosphate buffer solution） TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（tris acetate-EDTA buffer） 3 原理 PDCoV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PDCoV M基因保守基因 序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延 伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。依据PCR试验结果，判断样品中是否含有PDCoV。 4 主要仪器设备 生物安全柜、组织研磨机、涡旋振荡器、台式低温高速离心机、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像系统、 分析天平（精度 0.01g）、超低温冰箱（-80℃）等。 5 试剂与引物 5.1 试剂 1 DB12/T 1019—2020 Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、DEPC处理的灭菌去离子水、Taq DNA 聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、核酸染料、磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.2）、TAE电 泳缓冲液、琼脂糖。相关溶液配制方法见附录A。试剂均为分析纯。 5.2 引物 PDCoV M基因PCR扩增方法所用引物见表1： 表1 PDCoV M 基因 PCR 扩增方法引物 引物名称 引物序列 引物浓度 上游引物P1 5'-ATTCTGCTTTGGCTGCTC-3' 10 μmoL/L 下游引物P2 5'-TCCTGTGGCGGATTTC-3' 10 μmoL/L 扩增产物大小 359 bp 6 样品对照 样品对照如下： ——阳性对照样品：PDCoV 接种的 PK-15 细胞培养物； ——阴性对照样品：正常 PK-15 细胞培养物。 7 方法步骤 7.1 样品的采集及处理 7.1.1 采样工具 1.5 mL离心管、剪刀、镊子和棉拭子，经121（±2）℃，15 min高压灭菌，50℃～60℃烘干备用。 7.1.2 采样方法 肠及肠内容物：选择空肠或回肠肠段，用绳子将肠两端扎紧，用剪刀采集肠及肠内容物等，放入一 次性灭菌容器。 粪便：取发病猪新鲜粪便或者将棉拭子深入肛门转一圈蘸取粪便，将采集后的样本放入盛有0.5 mL PBS溶液的1.5 mL离心管中。 细胞培养物：将待检细胞培养物置-20℃冰箱冰冻12 h，解冻后震荡使细胞培养物脱离瓶壁，取0.3 mL混合液放入1.5 mL离心管中。 7.1.3 样品保存及运输 将采集的样品放入保温箱中，加入干冰，密封，24 h内送至实验室。 7.1.4 样品处理 肠组织及肠内容物：剪碎，用组织研磨机充分研磨，并按照质量体积比1:5加入PBS，冻融3次，转 移至1.5 mL离心管离心，4℃，4000 rpm/min，10 min，取上清液-80℃保存备用。 粪便：将含样品的离心管在涡旋振荡器上充分混合，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，弃去 拭子，进行离心，4℃，4000 rpm/min，10 min，取上清液-80℃保存备用。 细胞培养物：冻融3次，转入1.5 mL离心管中，4000 rpm/min，10 min，取上清液-80℃保存备用。 2 DB12/T 1019—2020 7.2 RNA 提取 7.2.1 用 Trizol 提取待测样品、阳性对照和阴性对照样品的 RNA。取 200 μL 的样品和 800 μL Trizol 置于一个 1.5 mL 离心管，反复颠倒混匀，室温静置 5 min。 7.2.2 向各管中加入 200 μL 2℃～8℃预冷的氯仿，剧烈震荡 15 s，室温静置 5 min。 7.2.3 12000 rpm/min，4℃下离心 15 min，将每管中的上层含 RNA 的水相转移到一个新的 1.5 mL 离 心管中。 7.2.4 向管中加入等体积 2℃～8℃预冷的异丙醇，充分混合液体，室温静置 15 min。在 12000rpm/min 4℃下离心 15 min，弃去上层的清液。 7.2.5 用冰冷的 DEPC 处理的 75%乙醇洗涤沉淀，温和震荡离心管，12000 rpm/min，4℃离心 10 min， 吸去上层清液。 7.2.6 打开离心管管盖，在室温下放置 5 min～10 min，加入 50 μL DEPC 水。提取的 RNA 须在 2 h 内 进行 RT-PCR 扩增，若需长期保存，需置于-80℃的冰箱保存。 7.2.7 也可采用商品化的 RNA 提取试剂，按照说明书进行操作。同时进行阴阳对照样品 RNA 的提取。 7.3 反转录反应（cDNA 的合成） 将上述步骤所得的病毒总RNA进行反转录反应。反转录体系为：5×MLV 缓冲液 4 µL，氯化镁 2 µL， dNTP 2 µL，随机引物 1 µL，M-MLV反转录酶 0.5 µL，Rnase抑制剂 0.5 µL，RNA 10 µL。反转录反应 条件为：30℃ 10 min，42℃ 1 h，99℃ 5 min。得到的cDNA溶液直接用于下面的PCR扩增或者-20℃冻 存备用。 7.4 PCR 反应 将上述步骤得到的样品cDNA进行PCR反应。PCR反应体系为：10×rTaq Buffer 2 µL，氯化镁 1 µL， dNTP 2 µL，上游引物P1 1 µL，下游引物P2 1 µL，cDNA 4 µL，rTaq 0.5 µL，加入灭菌双蒸水定容至 最终总体积20 µL。充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30 cycles；72℃ 7 min。 7.5 电泳及观察 将PCR扩增产物8 μL与2 μL上样缓冲液混合，点样于1％琼脂糖凝胶板加样孔中，琼脂糖凝胶板一 侧点样孔加入DL2000 DNA Marker（分子质量标准物），电泳缓冲液为1×TAE，电泳条件为100 V，20 min 左右。将电泳产物取出，置于凝胶成像系统下观察并拍照，以分子质量标准为参照判断扩增产物大小。 8 结果判定 8.1 质控标准 当阳性对照出现359 bp扩增条带，阴性对照未出现目的条带，阴性、阳性同时成立表明实验结果有 效，否则实验无效。 8.2 结果判定 结果判定如下： ——阴性：被检样品未出现 359 bp 扩增条带，判为 PDCoV 核酸阴性，如图 1 所示； ——阳性：被检样品出现 359 bp 扩增条带，判为 PDCoV 核酸阳性，如图 1 所示。 3 DB12/T 1019—2020 注：M：DNA分子质量标准；1：阴性对照样品；2：阳性对照样品 图1 PDCoV RT-PCR 产物电泳结果 4 DB12/T 1019—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 溶液配制 A.1 PBS缓冲液 A.1.1 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠71.6 g，加适量灭菌去离子水溶解，定容至1000 mL，混匀。 A.1.2 0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠27.6 g，加适量灭菌去离子水溶解，定容至1000 mL，混匀。 A.1.3 量取0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液36 mL，0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液14 mL，称取氯化钠8.5 g， 用灭菌去离子水溶解稀释至1000 mL，4℃保存。 A.2 50×TAE电泳缓冲液 A.2.1 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0） 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61 g 灭菌双蒸水 80 mL 2%氢氧化钠溶液 调pH至8.0 灭菌双蒸水 加至100 mL A.2.2 TAE电泳缓冲液（50×） 羟基甲基氨基甲烷（Tris） 242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH 8 .0) 100 mL 灭菌双蒸水 加至1000 mL A.3 1％琼脂糖凝胶 琼脂糖（电泳级） 1 g 1×TAE 电泳缓冲液 100 mL 微波炉中完全融化，降温至60℃左右，加核酸染料5 μL，均匀铺板。 A.4 DEPC水 取DEPC 100 μL，加灭菌去离子水至100 mL，室温放置6-8 h，121（±2）℃，15 min高压灭菌，分 装到1.5 mL DEPC处理过的离心管。 _________________________________ 5