ICS 65.020.30 CCS B 41 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB 42/T 1594—2020 猪丹毒（红斑丹毒丝菌）PCR 鉴别诊断技术 规程 Technical procedures of PCR differential diagnosis for detection of virulent and avirulent swine erysipelas (Erysipelothrixrhusiopathiae) 2020 - 07 - 07 发布 湖北省市场监督管理局 2020 - 11 - 07 实施 发 布 DB42/T XXXXX—2020 目  次 前言..................................................................................................................................................................... II 引言................................................................................................................................................................... III 1 范围................................................................................................................................................................. 1 2 规范性引用文件............................................................................................................................................. 1 3 术语与定义..................................................................................................................................................... 1 4 检测原理......................................................................................................................................................... 1 5 检测条件......................................................................................................................................................... 1 6 检测方法......................................................................................................................................................... 2 7 结果判定......................................................................................................................................................... 2 8 注意事项......................................................................................................................................................... 2 附录 A（规范性附录） 试剂的配制................................................................................................................3 I DB42/T XXXXX—2020 前  言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规 则起草。 本文件由华中农业大学提出。 本文件由湖北省农业农村厅归口管理。 本文件起草单位：华中农业大学、武汉科前生物股份有限公司。 本文件主要起草人：金梅林、吴超、朱伟峰、孙小美、范俊青、康超、徐高原。 本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑 问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话 ： 027-87665821 ， 邮 箱 ： [email protected]；华中农业大学，联系电话：027-87282038，邮箱：[email protected]。 对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 建 议 请 反 馈 至 华 中 农 业 大 学 ， 电 话 ： 027-87286905 ， 邮 箱 ： [email protected]。 II DB42/T XXXXX—2020 引  言 猪丹毒是一种重要的人畜共患病，由红斑丹毒丝菌（俗称猪丹毒杆菌）引起。猪丹毒可导致生猪从 业人员中的特定人群感染和死亡，严重危害人类健康，同时给我国养猪业造成巨大经济损失。为此，制 定了《猪丹毒（红斑丹毒丝菌）PCR鉴别诊断技术规程》标准，建立了一种既可以鉴定红斑丹毒丝菌临 床分离株又可以同时区分疫苗菌株和野生型菌株的双重PCR方法，有利于该病的早发现、早报告、早处 置，为防控节省时间，为猪丹毒的快速诊断、猪丹毒野生毒株与疫苗弱毒株的鉴别诊断提供了精确简便 的分子生物学方法，对当前防控猪丹毒具有重大意义。 III DB42/T XXXXX—2020 猪丹毒（红斑丹毒丝菌）PCR 鉴别诊断技术规程 1 范围 本文件规定了猪丹毒（红斑丹毒丝菌）PCR鉴别诊断技术的术语与定义、检测原理、检测条件、检 测方法、结果判定等。 本文件适用于猪丹毒（红斑丹毒丝菌）的鉴别诊断。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 双重 PCR 法 duplex PCR 指在同一PCR反应体系里加入两对引物，针对两个DNA模板或者同一个DNA模板的两个不同区域进行 扩增，最多可同时扩增出两条核酸片段的PCR反应。 4 检测原理 利用红斑丹毒丝菌弱毒疫苗株G4T10和GC42与野毒株关于DNA聚合酶IV基因上的差异，设计猪丹毒疫 苗株的特异性引物，结合猪丹毒杆菌的种特异性引物，建立起一种快速检测猪丹毒菌株并同时区分猪丹 毒弱毒疫苗株和野毒株的双重PCR法。 5 5.1 检测条件 实验室 实验操作宜在室温下进行。 5.2 仪器及耗材 PCR仪、 琼脂糖凝胶电泳仪、组织研磨仪、凝胶成像系统、电磁炉、微量移液器（0.1µL -2.5 µL、 0.5μL -10μL、5µL-50µL、10µL -100μL、100µL -1mL）、离心机（12000rpm）、恒温箱（37℃）、水 浴锅（55-60℃）、电子天平（0.01g-300g）离心管（0.2mL、1.5mL） 5.3 试剂 1 DB42/T XXXXX—2020 DNA聚合酶EasyTaq、EasyTaq 10buffer、dNTPs、去离子水、DNA Marker（包含500 bp，1000 bp 条带）、阳性对照1、阳性对照2、阴性对照、 蛋白酶K（100µg/mL）、Gold View核酸染料、溴酚蓝上 样缓冲液、琼脂糖凝胶（10g/L）、PBS缓冲液、TAE电泳缓冲液、引物。 6 检测方法 6.1 样品准备 采集发病猪的心、肺、肾、肝、脾、脑及关节样品组织，将0.5g样品组织剪碎加入2mL PBS匀浆， 匀浆操作时间30秒，共3次。于37℃培养5h，加蛋白酶K（100µg/mL）于55-60℃水浴1h。取1mL消化产 物于离心管中，沸水中加热5min并快速置于冰浴中5min，12000rpm离心2min，取上清即为样品DNA。 6.2 PCR 扩增 以提取的样品DNA为模板进行PCR反应。 PCR反应体系（25μL）：引物vaccine-F 20µmol/L 1µL，引物vaccine-R 20µmol/L 1µL，ER1 20µmol/L 1µL，ER2 20µmol/L 1µL，dNTPs 2µL，EasyTaq 0.5µL，EasyTaq 10buffer 2.5µL，去离子水15µL， 样本DNA 1µL。 PCR反应条件：1：94℃ 2min；2：94℃ 30sec；3：55℃ 30sec；4：72℃ 1min；5：72℃ 2min， 其中2，3，4循环35次。 6.3 琼脂糖凝胶电泳 PCR反应扩增完成后，向产物中加入0.1%的溴酚蓝上样缓冲液。使用1倍TAE电泳缓冲液配制10g/L 的琼脂糖凝胶，凝胶中加入0.005%的GoldView染料进行染色。电泳完成后于凝胶成像系统下观察。 7 结果判定 阳性对照1扩增出453bp片段和937bp片段，阳性对照2扩增出937bp片段，阴性对照不能扩增出任何 片段，判定为检测结果成立，否则判定为检测结果不成立。 在试验结果成立的前提下，同时扩增出453bp和937bp片段，判定为猪丹毒疫苗株；仅扩增出937bp 片段，判定为猪丹毒野毒株。 8 注意事项 采样及检测过程中应注意个人防护，戴口罩和手套、穿工作服；在无污染环境中操作，及时清理物 品，用75%酒精对操作区域消毒处理；废弃物经高压灭菌后按有关规定处理。 2 DB42/T XXXXX—2020 AA 附 录 A （规范性） 试剂的配制 A.1 商品化试剂 DNA聚合酶Easy