ICS 65.020.30 CCS B 41 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB 42/T 1593—2020 4 型禽腺病毒抗体 ELISA 检测规程 Technical procedures of the ELISA assays for detection of type 4 avian adenovirus 2020 - 07 - 07 发布 湖北省市场监督管理局 2020 - 11 - 07 实施 发 布 DB42/T —2020 目  次 前言..................................................................................................................................................................... II 引言................................................................................................................................................................... III 1 范围................................................................................................................................................................. 1 2 规范性引用文件............................................................................................................................................. 1 3 术语和定义..................................................................................................................................................... 1 4 实验原理......................................................................................................................................................... 1 5 检测条件......................................................................................................................................................... 1 6 检测方法......................................................................................................................................................... 2 7 结果判定......................................................................................................................................................... 3 8 废弃物处理和防止污染的措施..................................................................................................................... 3 附录 A（规范性附录） 试剂的配制................................................................................................................4 I DB42/T —2020 前  言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规 则起草。 本文件由华中农业大学提出。 本文件由湖北省农业厅归口管理。 本文件起草单位：华中农业大学，武汉科前生物股份有限公司。 本文件主要起草人：金梅林、张雪、邹忠、林显、孙小美、董晓辉、徐高原。 本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑 问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话 ： 027-87665821 ， 邮 箱 ： [email protected]；华中农业大学，联系电话：027-87282038，邮箱：[email protected]。 对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 建 议 请 反 馈 至 华 中 农 业 大 学 ， 电 话 ： 027-87286905 ， 邮 箱 ： [email protected]。 II DB42/T —2020 引  言 禽腺病毒属于禽腺病毒科禽腺病毒属，根据其抗原性的不同可分为3个群，根据血清中和反应I群禽 腺病毒包含12个血清型，4型禽腺病毒主要感染3周龄～5周龄鸡。我国主要流行血清型有：2型、4型、 8a/b型和10型。近期在豫南、皖北、苏北、鲁西北和胶东地区流行的禽腺病毒主要是血清4型和8a/b型， 造成鸡群的死亡率较高，发病急，有蔓延的趋势。对我国的养禽业造成了巨大的经济损失。 III DB42/T —2020 4 型禽腺病毒抗体 ELISA 检测规程 1 范围 本文件规定了4型禽腺病毒抗体ELISA检测的术语和定义、实验原理、检测条件、检测方法、结果判 定、废弃物处理和防止污染的措施。 本文件适用于4型禽腺病毒鸡血清抗体的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 实验原理 本文件采用酶联免疫吸附法（ELISA），该方法利用抗原抗体反应具有特异性，将特异性的4型禽腺 病毒五邻体蛋白（penton）吸附到固相载体的表面后，待测物中若含有相应的4型禽腺病毒抗体，则可 与所包被的五邻体蛋白（penton）相结合，并能继续和相应的辣根过氧化物酶标记的鸡IgG抗体结合形 成复合物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与待测物中4型禽腺病毒抗体 的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫 反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 5 检测条件 5.1 试剂及耗材 5.1.1 试剂 纯化的4型禽腺病毒五邻体蛋白（penton）、酶标记物（辣根过氧化物酶标记的鸡IgG抗体）、底物 液显色液、终止液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、包被液、封闭液。 试剂配方及4型禽腺病毒五邻体蛋白、阳性对照、阴性对照的制备见附录A。 5.1.2 耗材 酶标板（96孔）。 5.2 设备 1 DB42/T —2020 酶标检测仪（配备450nm滤光片）、单道移液器（10μL）、8道移液器（300μL）、微量振荡器、恒 温箱（37℃）。 6 检测方法 6.1 抗原包被板的制备 6.1.1 包被 将纯化的4型禽腺病毒五邻体蛋白（penton）用包被液稀释到0.625ng/μL，加入酶标板中，每孔加 100μL，2℃～8℃包被12-15h。 6.1.2 封闭 弃去包被液，每孔加入封闭液200μL，置37℃ 恒温箱中温育2h；弃去孔中液体，再置37℃恒温箱中 干燥2h，密封2℃～8℃保存。 6.2 洗涤液的配制 使用前，将20倍浓缩洗涤液恢复至室温22℃～25℃，并摇动使沉淀溶解，按照50mL 20倍浓缩洗涤 液加入950mL去离子水的比例稀释，稀释好的洗涤液在2℃～8℃保存，有效期为7日。 6.3 待检血清的稀释 将5μL血清加入到95μL样品稀释液中，微量振荡器混匀，再取5μL混匀后的血清加入到120μL样品稀 释液中，微量振荡器混匀备用。 6.4 检测步骤 6.4.1 待检样品温育 从冷藏环境中取出包被板，平衡至室温22℃～25℃后打开使用。先用洗涤液洗涤抗原包被板1次， 弃去孔中洗涤液，将稀释好的待检血清、阴性对照和阳性对照各取100μL，加至抗原包被板中，阴、阳 性对照各设2孔，置37℃恒温箱中温育45min。 阴性对照血清和阳性对照血清无需稀释。 6.4.2 洗涤 弃去孔中液体，每孔加入洗涤液300μL/孔，重复洗涤4次，最后一次拍干。 6.4.3 酶标记物的温育 将辣根过氧化物酶标记的鸡IgG抗体用封闭液作1:20000倍稀释，每孔加入100μL，置37℃恒温箱中 温育45min。 6.4.4 洗涤 重复步骤5.4.2。 6.4.5 底物显色 每个反应孔加入底物显色液100μL，置22℃～28℃下避光显色15min。 2 DB42/T —2020 6.4.6 终止 每孔加终止液50μL，10min内用酶标仪在波长450nm处测定各孔的OD值结果。 7 7.1 结果判定 试验成立条件 两个阳性对照孔的OD450nm值均＞1.0，且相差＜0.2；阴性对照孔OD450nm值均＜0.3时试验成立。 7.2 结果计算 Cut-off值按式（1）确定： Cut  off值（CO） SN PN ………………………………………………（1） 式中： CO——阴阳性判定临界值； S——样品测定孔OD450nm值； P——阳性对照孔平均OD450nm值； N——阴性对照孔平均OD450nm值。 7.3 结果判定 CO＞0.15判定为阳性；CO≤0