ICS 65.020.30 CCS B 41 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB 42/T 1589—2020 H7 亚型禽流感病毒竞争 ELISA 抗体检测方 法 Competitive ELISA for detection of antibodies against H7 subtype avian influenza virus 2020 - 07 - 07 发布 湖北省市场监督管理局 2020 - 11 - 07 实施 发 布 DB42/T XXXXX—2020 目  次 前言..................................................................................................................................................................... II 引言................................................................................................................................................................... III 1 范围................................................................................................................................................................. 1 2 规范性引用文件............................................................................................................................................. 1 3 术语与定义..................................................................................................................................................... 1 4 检测原理......................................................................................................................................................... 1 5 检测条件......................................................................................................................................................... 1 6 操作步骤......................................................................................................................................................... 2 7 结果判定......................................................................................................................................................... 2 附录 A（资料性附录） 酶标抗体的制备........................................................................................................4 附录 B（资料性附录） 对照品的制备............................................................................................................7 附录 C（规范性附录） 试剂配制....................................................................................................................8 附录 D（资料性附录） 样品处理注意事项................................................................................................... 9 I DB42/T XXXXX—2020 前  言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规 则起草。 本文件由华中农业大学提出。 本文件由湖北省农业农村厅归口管理。 本文件起草单位：华中农业大学、武汉科前生物股份有限公司。 本文件主要起草人：金梅林、范俊青、李冉、董俊、王园园、但汉并、吴超、董晓辉、徐高原。 本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑 问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话 ： 027-87665821 ， 邮 箱 ： [email protected]；华中农业大学，联系电话：027-87282038，邮箱：[email protected]。对本文件 的有关修改意见建议请反馈至华中农业大学，电话：027-87286905，邮箱：[email protected]。 II DB42/T XXXXX—2020 引  言 禽流感（avian influenza,AI）是由甲型流感病毒感染引起的禽类急性传染病。按照致病力的强弱 可分为无致病性禽流感、低致病性禽流感、中致病性禽流感和高致病性禽流感。禽流感病毒H7亚型属于 高致病性禽流感，OIE将高致病性禽流感列为必须上报的传染病，我国将其列为是优先防治和重点防范 的人兽共患病。 目前，检测H7亚型禽流感病毒抗体的经典方法是血凝抑制（HI）试验，该方法的优点是对试验条件 要求低，缺点是：操作繁琐，实验结果重复性差，灵敏度低，凝集情况的准确判断需要大量观察后总结 经验，受主观影响因素较大。H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测方法是用纯化的病毒作为包被抗原， 包被酶标板，同时加入待检血清和抗HA蛋白单克隆抗体的酶标记物，使血清中的抗体与单抗竞争包被板 上的抗原表位，从而判断血清中是否含有H7亚型禽流感病毒抗体的一种方法，是一种操作简便、检出率 高、敏感性高、特异性强的方法，且能实现高通量检测和标准化，结果更客观，判定方便、直观、快速 准确。 III DB42/T XXXXX—2020 H7 亚型禽流感病毒竞争 ELISA 抗体检测方法 1 范围 本文件规定了H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测的术语与定义、检测原理、检测条件、操作步 骤、结果判定。 本文件适用于H7亚型禽流感病毒抗体的检测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 辣根过氧化物酶 HRP（horseradish peroxidase, HRP） 通常来源于辣根，因此称辣根过氧化物酶，是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个 生化检测项目，也广泛运用于免疫类(ELISA)试剂盒。 4 检测原理 本文件采用竞争酶联免疫吸附法（cELISA）的原理，待检血清中的抗体和酶标抗体竞争与固相抗原 结合，如检血清中抗体含量越多，则与固相抗原结合的酶标抗体就越少，经底物催化后显色越浅。将H7 亚型禽流感病毒血凝抑制试验抗原吸附到固相载体的表面形成固相抗原，待检血清和酶标抗体同时加入 包被板，若待检血清中含有抗体，则可与抗原相结合，同时酶标抗体也抗原的结合量减少；加入底物后， 底物被酶标抗体中的HRP催化成为有色产物，产物的量与待检血清中抗体的量呈负相关，故可根据呈色 的深浅进行定性分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使检测方法具有良好的 敏感性。 5 5.1 检测条件 仪器与耗材 Ⅱ级生物安全柜或者超净工作台、酶标仪（配制450nm波长滤光片）、离心机（4000r/min）、微量 可调移液器（200µL、1 mL）、枪头（200µL、 1mL）、恒温箱（37℃）、电子天平（0.01g-300g）、 聚苯乙烯微量反应板（96孔）、离心管（1.5mL、2mL、5mL）。 5.2 试剂 1 DB42/T XXXXX—2020 HRP标的记H7亚型禽流感病毒单克隆抗体、H7亚型禽流感病毒血凝抑制试验抗原、底物液、终止液、 包被液、封闭液、20倍浓缩洗涤液、样品稀释液、阴性对照品、阳性对照品。 H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备、纯化及HRP标记方法见附录A。 阴性对照品、阳性对照品的制备方法见附录B。 试剂配制方法见附录C。 6 操作步骤 6.1 样品处理 取动物全血，待血液充分凝固后，4000r/min离心10min，收集上清。要求血清清亮，无溶血。样品 处理过程中应防止样品的污染，注意个人安全防护，具体注意事项见附录D。 6.2 抗原包被板的制备 6.2.1 包被 用包被液将H7亚型禽流感病毒血凝抑制试验抗原稀释至工作浓度（0.2μg/mL）加至酶标板孔中，每 孔100μL，在2～8℃放置15h。 6.2.2 封闭 弃去包被液，每孔加入封闭液200μL，置37℃孵育2h；弃去封闭液，拍干，再置37℃干燥2h。 6.3 洗涤液的配制 使用前，将20倍浓缩洗涤液恢复至室温（22-25℃）并摇动使沉淀溶解，按照50mL 20倍浓缩洗涤液 加入950mL去离子水的比例稀释，稀释好的洗涤液在2-8℃保存，有效期为7日。 6.4 洗涤 弃去孔中液体，每孔加入配制好的洗涤液200μL，弃去孔中液体。洗涤4次，最后一次在吸水纸上拍 干。 6.5