ICS 65.020.30 CCS B 41 湖 42 北 省 地 方 标 准 DB42/T 1590—2020 H7 亚型禽流感病毒胶体金试纸条抗原检测 方法 Colloidal gold strips test for detecting of H7 subtype avian influenza virus 2020 - 07 - 07 发布 湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局  发 布 2020 - 11 - 07 实施  FORMTEXT  DB42/T   目 FORMTEXT  1590 — FORMTEXT  2020 次 前言....................................................................................................................................................................... II 引言..................................................................................................................................................................... III 1 范围................................................................................................................................................................... 1 2 规范性引用文件............................................................................................................................................... 1 3 术语和定义....................................................................................................................................................... 1 4 检测原理........................................................................................................................................................... 1 5 检测条件........................................................................................................................................................... 2 6 检测方法........................................................................................................................................................... 2 7 结果判定........................................................................................................................................................... 2 附录 A（规范性） 试剂配制.............................................................................................................................. 4 附录 B（资料性） H7 亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备............................................................................ 5 附录 C（资料性） 胶体金试纸条的制备..........................................................................................................8 附录 D（资料性） 样品处理注意事项..............................................................................................................9 I  FORMTEXT  DB42/T   FORMTEXT  1590 — 前 FORMTEXT  2020 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由华中农业大学提出。 本文件由湖北省农业农村厅归口。 本文件起草单位：华中农业大学、武汉科前生物股份有限公司。 本文件主要起草人：金梅林、范俊青、李冉、董俊、王园园、但汉并、邹忠、董晓辉、徐高原。 本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑 问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话 ： 027-87665821 ， 邮 箱 ： [email protected]；华中农业大学，联系电话：027-87282038，邮箱：[email protected]。对本文件 的有关修改意见建议请反馈至华中农业大学，电话：027-87286905，邮箱：[email protected]。 II  FORMTEXT  DB42/T   引 FORMTEXT  1590 — FORMTEXT  2020 言 禽流感（avian influenza, AI）是由甲型流感病毒感染引起的禽类急性传染病。按照致病力的强 弱可分为无致病性禽流感、低致病性禽流感、中致病性禽流感和高致病性禽流感。禽流感病毒H7亚型属 于高致病性禽流感，OIE将高致病性禽流感列为必须上报的传染病，我国将其列为是优先防治和重点防 范的人兽共患病。 目前，检测H7亚型禽流感病毒的方法主要是荧光定量PCR方法，该方法的优点是敏感性高，缺点是 对操作人员的专业素养要求高，试验条件苛刻，仪器使用昂贵。H7亚型禽流感病毒的胶体金检测方法， 是一种现场快速检测H7亚型禽流感病毒的方法，该方法有利于该病的早发现、早报告、早处置，为防控 节省时间；同时给临床检测提供一种简单，便捷的检测工具，使高通量检测成为可能，从而切实为实际 生产提供便利。 III  FORMTEXT  DB42/T   FORMTEXT  1590 — FORMTEXT  2020 H7 亚型禽流感病毒胶体金试纸条抗原检测方法 1 范围 本文件规定了H7亚型禽流感病毒胶体金试纸条抗原检测的术语和定义、检测原理、检测条件、检测 方法、结果判定。 本文件适用于H7亚型禽流感病毒的检测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 检测原理 本文件采用双抗夹心检测抗原的方法制备胶体金试纸条，属于一步式固相膜反应。首先制备两株具 有夹心效果的H7亚型禽流感病毒单克隆抗体，一株单抗包被在硝酸纤维素膜上，另一株单抗进行胶体金 标记，固定在金垫上。在加样孔处（A）加入待检样品时，待检样 品中的抗原先与胶体金标记的单抗进行反应，形成肉眼可见的红色金标抗体-抗原结合物。然后， 经毛细管作用，该红色结合物继续层析向前移动，与硝酸纤维素膜上的单抗结合，在观察窗口的检测线 （T）处，红色结合物中的抗原被此处预先包被在纤维素膜上的抗体捕获并截留下来，随着红色结合物 截留量增多，逐渐形成一条红线，因此根据红色T线的出现即可判定样品为阳性。如果样品中没有抗原， 则不形成红色金标抗体-抗原结合物，流过T线时，不发生捕获截留，T线保持白色，判定样品为阴性。 （检测时质控线（C）处出现红线检测结果有效） 胶体金试纸条结构如图1所示： A S T C 注：A：加样孔；S：检测区；T：检测线；C：质控线 图1 胶体金试纸条结构示意图 1  FORMTEXT  DB42/T   5 检测条件 5.1 FORMTEXT  1590 — FORMTEXT  2020 仪器与耗材 Ⅱ级生物安全柜或者超净工作台、冷冻离心机（转速12,000r/min）、电子天平（0.01g-300g）、 玻璃匀浆器（5mL）、微量可调移液器（200µL、1 mL）、枪头（200µL、 1mL）、离心管（1.5mL、2mL、 5mL）。 5.2 试剂 H7亚型禽流感病毒单克隆抗体、样本处理液、生理盐水 试剂配制方法见附录A。 H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备、纯化及鉴定见附录B。 6 检测方法 6.1 样品处理 6.1.1 泄殖腔拭子检测样本的处理 将采集的泄殖腔棉拭子插入到含有处理液的离心管中，充分混合， 置低温冷冻离心机 4℃、12,000r/min 离心 10min，取上清待检。 6.1.2 内脏组织检测样本的处理 称取内脏组织块 0.5g，置于匀浆器中，加生理盐水 1mL，研磨完全 后取出组织浸出液至离心管中，然后置低温冷冻离心机 4℃、12,000r/min 离心 10min，取上清待检。 6.1.3 鸡胚分离病毒尿囊液样本的处理 收集尿囊液至离心管中，置低温冷冻离心机 4℃、12,000 r /min 离心 2min，取上清待检。 6.1.4 细胞培养病毒样本的处理 细胞培养液可直接用于检测或者冻融一次后检测。 6.1.5 样品处理过程中应