ICS 11.220 B 41 DB33 浙 江 省 地 方 标 准 DB33/T 2268—2020 猫细小病毒 PCR 检测方法 PCR detection technique for feline panleukopenia virus 2020 - 06 - 30 发布 浙江省市场监督管理局 2020 - 07 - 30 实施 发 布 DB33/T 2268—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009的规定编写。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：张红丽、徐 辉、赵灵燕、周彩琴、吴贇竑、黄 靖、吕见涛、刘爱军、刘 霞、 吴雪军、孙冰冰、章杭建。 I DB33/T 2268—2020 猫细小病毒 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猫细小病毒PCR（polymerase chain reaction）的实验条件、操作步骤、结果判定。 本标准适用于猫细小病毒（猫泛白细胞减少症病毒）的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 猫细小病毒 Feline panleukopenia virus，FPLV 属细小病毒科，细小病毒亚科，牛犬细小病毒属成员，又称猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性胃肠 炎病毒或猫瘟病毒。 4 实验条件 4.1 试剂 4.1.1 要求 除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂，水为符合GB/T 6682要求的灭菌双蒸水或超纯水。 4.1.2 试剂 4.1.2.1 核糖核酸酶（20 mg/mL）。 4.1.2.2 10%十二烷基磺酸钠溶液。 4.1.2.3 10 mg/mL 蛋白酶 K。 4.1.2.4 Tris-盐酸饱和酚（pH 7.6）。 4.1.2.5 酚-氯仿-异戊醇混合液（25：24：1）：在一灭菌棕色瓶中按 25：24：1 比例分别加入酚、氯 仿、异戊醇。 4.1.2.6 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.4）。 4.1.2.7 琼脂糖。 1 DB33/T 2268—2020 4.1.2.8 10 μg/μL 溴化乙锭（ethidium bromide， EB）：溴化乙锭 20 mg、加灭菌双蒸水至 20 mL 充 分溶解混匀而成。 4.1.2.9 50×TAE 缓冲液：羟基甲基氨基甲烷（Tris）242 g、冰乙酸 57.1 mL、0.5 mol/L 乙二铵四乙 酸二钠溶液（pH 8.0）100 mL，加灭菌双蒸水至 1 000 mL 充分混匀。 4.1.2.10 加样缓冲液：聚蔗糖 25 g、溴酚蓝 0.1 g、二甲苯青 0.1 g，加灭菌双蒸水至 100 mL 充分溶 解混匀而成。 4.1.2.11 2.5 mmol dNTPs（deoxyribonucleoside triphosphates，脱氧核糖核苷三磷酸）。 4.1.2.12 10×PCR Buffer。 4.1.2.13 DNA 分子量标准：DL2000。 4.1.2.14 引物序列 FPLV-F：5'—CCAGCTGAGGTTGGTTATAGTG—3'；FPLV-R：5'—GGTGCATTTACATGAAGTCTT GG—3'。 4.2 仪器设备 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6 4.2.7 4.2.8 4.2.9 4.2.10 4.2.11 高速冷冻离心机：要求最大离心力在 12 000rpm 以上。 PCR 扩增仪。 核酸电泳仪和水平电泳槽。 微波炉。 分析天平。 恒温水浴锅。 冷藏冰箱和低温冷冻冰箱。 微量移液器。 凝胶成像系统（或紫外透射仪）。 高压灭菌锅。 超净工作台或生物安全柜。 5 操作步骤 5.1 样品的采集和处理 5.1.1 a) b) c) 采集动物粪便、肛拭子、全血或肠道等组织样品并进行处理: 肛拭子、粪便（加适量 PBS）等样品经 4 ℃ 5 000 rpm/min 离心 2 min，取上清液； 全血样品待血凝后经 5 000 rpm/min 离心 2 min，取血清； 取 0.1 g 肠道等样品与灭菌 PBS（全称、浓度）按 1：5 的重量体积比制成悬液，匀浆后，反复 冻融 3 次，在涡旋混合器上混匀后经 4 ℃ 5 000 rpm/min 离心 10 min，取上清液。 5.1.2 制备的样品在 2 ℃～8 ℃保存时间不应超过 24 h，长期保存应分装成小管，置于-20 ℃以下，避 免反复冻融。 5.2 DNA 的提取 5.2.1 设立阳性、阴性样品对照，阳性对照为猫细小病毒阳性样品，阴性对照为灭菌双蒸水。 5.2.2 按下列步骤完成 DNA 的提取，也可选择市售商品化 DNA 提取试剂盒，完成 DNA 的提取： a) 取 1.5 mL 灭菌离心管，加入处理样品 5.1.1 上清液 400 µL 和 30 µL（20 mg/mL）核糖核酸酶， 混匀后，室温下作用 20 min； 2 DB33/T 2268—2020 b) 加入 43 µL 10%的十二烷基磺酸钠溶液和 5 µL 蛋白酶 K，42 ℃水浴温育过夜（或 55 ℃30 min 以上）； c) 加入等量的 Tris-盐酸饱和酚，充分混匀，12 000 rpm/min 离心 5 min，小心吸出上层水相于 新的 1.5 mL 灭菌离心管中； d) 加等量的酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），充分混匀，12 000 rpm/min 离心 5 min，小心吸出上 层水相至新的 1.5 mL 灭菌离心管中； e) 加 1/10 体积 3 mol/L 的乙酸钠（pH 5.4），2.5 倍体积预冷的无水乙醇 15 000 rpm/min 离心 20 min，弃去乙醇，75%的乙醇洗涤沉淀一次后真空干燥。用 20 µL 灭菌双蒸水溶解沉淀，-20 ℃ 保存备用。 5.3 PCR 反应 5.3.1 反应体系组成 设立阳性对照和阴性对照。按表 1 所述反应体系组成，严格在冰盒上配置 25 µL PCR 扩增体系。 表1 每个样品反应体系配制表 试剂 用量（µL） 10×PCR buffer 2.5 dNTPs（2.5 mM） 2 FPLV-F/FPLV-R（20 uM） 各 0.5 TaqDNA 聚合酶（Taq DNA Polymerase） 0.2 DNA 模板 1 灭菌双蒸/超纯水 18.3 总量 25 5.3.2 反应条件 94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环 35 次，72 ℃延伸 10 min 结束。 5.4 电泳 5.4.1 1%琼脂糖凝胶的制备 用琼脂糖1.0 g，0.5×TAE 电泳缓冲液100 mL，混匀后在微波炉中完全融化，待冷至50 ℃～60 ℃时， 加溴化乙锭（EB）溶液5 μL，摇匀倒入电泳板上，凝固后取下梳子，备用。 5.4.2 加样 取5 μL PCR产物与0.5 μL 10×加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。每次电泳加阳性 对照和阴性对照的扩增产物，并设立DNA分子量标准（DL2000）做分子质量大小对照。 5.4.3 电泳 3 DB33/T 2268—2020 盖好电泳仪，插好电极，5 V/cm 电压电泳，30 min～45 min（指示试剂跑至 1/3 处）。 5.4.4 结果观察 用紫外凝胶成像仪或者紫外透射仪观察扩增结果。 6 结果判定 在阳性对照出现 464 bp 的扩增带、阴性对照无目的条带的条件下，待检样品出现 464 bp 的扩增条 带，则判定为样品阳性，否则判定为阴性。 _________________________________ 4