ICS 11.220 B 41 DB14 山 西 省 地 方 标 准 DB 14/ T 1804—2019 猪流行性腹泻病毒抗体 ELISA 检测方法 2019 - 06 - 25 发布 山西省市场监督管理局 2019 - 08 - 25 实施 发 布 DB14/ T 1804—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 缩略语 ............................................................................ 1 3 实验原理 .......................................................................... 1 4 实验条件 .......................................................................... 1 5 实验方法 .......................................................................... 1 6 结果判定 .......................................................................... 2 7 注意事项 .......................................................................... 3 附录 A（规范性附录） 试剂配制方法 .................................................... 4 I DB14/ T 1804—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由山西省农业农村厅提出并监督实施。 本标准由山西省农村标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山西省动物疫病预防控制中心、武汉科前生物股份有限公司。 本标准主要起草人：杨治平、王仲兵、郎小兵、雷宇平、董晓辉、但汉并、卢月、张仲萍、孙杰、 胡明明、左晓、图门巴雅尔、赵凯、张娟、郭永江、张昱。 II DB14/ T 1804—2019 猪流行性腹泻病毒抗体 ELISA 检测方法 1 范围 本标准规定了应用间接酶联免疫吸附法检测血清中猪流行性腹泻病毒抗体方法的缩略语、实验原 理、实验材料、实验条件、实验方法、结果判定和注意事项。 本标准适用于猪流行性腹泻病毒抗体的检测。 2 缩略语 ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay）。 OD：光密度值(optical density)。 HRP：辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)。 3 实验原理 本标准采用间接酶联免疫吸附法（间接ELISA），该方法利用抗原抗体反应具有特异性的特点，将 特异性的猪流行性腹泻病毒S蛋白包被固相载体酶标板，加入待检血清后，如果样品中含有猪流行性腹 泻病毒抗体，即可发生抗原抗体反应，再加入羊抗猪IgG-HRP（辣根过氧化物酶标记抗体），继续反应， 形成抗原抗体复合物，在遇到相应的底物时，复合物中的酶能催化底物反应发生显色。其显色的深浅与 相应的抗体量成正比，可借助OD450nm值的大小进行定性判断。 4 实验条件 4.1 实验室环境 实验操作在15 ℃～25 ℃下进行。未灭活的感染性材料的实验活动，应在Ⅱ级生物安全柜内进行。 4.2 仪器 Ⅱ级生物安全柜、离心机、酶标仪、洗板机（或手洗）、微量移液器、冰箱、恒温箱。 5 实验方法 5.1 实验材料 猪流行性腹泻病毒S蛋白包被抗原、羊抗猪IgG-HRP、底物液、终止液、样品稀释液、洗涤液、包被 液、封闭液。 试剂配制方法见附录A。 5.2 样品准备 1 DB14/ T 1804—2019 取动物全血，待血液充分凝固后，4 000 r/min离心10 min，收集血清。也可等凝固后自然析出血 清。血清应清亮，无溶血。 样品处理过程中应防止样品的污染，注意个人安全防护。 5.3 包被 用包被液将包被抗原稀释至工作浓度1.5 μg/mL，加至抗原包被板中，每孔100 μL，2 ℃～8 ℃ 包被15 h。 5.4 封闭 弃去包被液，每孔加入封闭液200 μL，置37 ℃±1 ℃孵育2 h；弃去封闭液，拍干，再置37 ℃± 1 ℃干燥2 h。 5.5 待检血清的稀释 待检血清在血清稀释板中按40倍稀释。 5.6 操作步骤 5.6.1 加样 取抗原包被板，先用洗涤液洗涤抗原包被板1次，稀释好的待检血清、阴性对照和阳性对照各取100 μL，加至抗原包被板中，每板待检血清设1孔，阴、阳性对照各设2孔，轻轻振匀孔中样品，置37℃±1℃ 下温育45 min。 5.6.2 洗涤 弃去孔中液体，每孔加入洗涤液200 μL，重复洗涤5次，最后一次拍干。 5.6.3 加酶标抗体 将辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体，用封闭液1:5 000稀释，每孔加100 μL，37 ℃±1 ℃放置 30 min。 5.6.4 洗涤 弃去孔中液体，每孔加入洗涤液200 μL，重复洗涤5次，最后一次拍干。 5.6.5 加底物液 每个反应孔加入底物液100 μL，置20 ℃～25 ℃下避光显色10 min。 5.6.6 加终止液 每孔加终止液50 μL，10 min内在酶标仪上测定450 nm波长处的吸光度（OD值）。 6 结果判定 试验成立的条件：阳性对照OD450nm值≥0.8，阴性对照OD450nm<0.25。 若被检样品（S-N）/(P-N)≥0.2，该样品判为猪流行性腹泻病毒抗体阳性；若被检样品（S-N） /(P-N)<0.2该样品判为猪流行性腹泻病毒抗体阴性。 2 DB14/ T 1804—2019 S=样品孔OD450nm值，N=阴性对照孔平均OD450nm值，P=阳性对照孔平均OD450nm值。 7 注意事项 7.1 人员防护 样品处理及实验过程中注意做好个人的安全防护工作。 7.2 样品处理 血清应在Ⅱ级生物安全柜中析出。 7.3 废弃物处理 操作区应有专门的固体和液体废弃物收集容器，废弃物经高压灭菌后按相关规定处理。 3 DB14/ T 1804—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂配制方法 A.1 包被液 包被液为碳酸盐缓冲液（0.025 mol/L，pH 9.6）。将下列试剂按序加入1 000 mL规格的容器中， 加800 mL蒸馏水充分溶解，定容至1 000 mL。 碳酸钠（Na2CO3） 1.59 g 碳酸氢钠（NaHCO3） 2.93 g 加蒸馏水至 1 000 mL A.2 洗涤液 氯化钠（NaCl） 氯化钾（KCl） 十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O） 磷酸二氢钾（KH2PO4） Tween-20 加蒸馏水至 8.0 g 0.2 g 2.9 g 0.2 g 0.5 mL 1 000 mL A.3 底物液 商品化TMB显色液。 A.4 终止液 98%浓硫酸（H2SO4） 加蒸馏水至 108.8 mL 1 000 mL A.5 样品稀释液 氯化钠（NaCl） 氯化钾（KCl） 十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O） 磷酸二氢钾（KH2PO4） 加蒸馏水至 8.0 g 0.2 g 2.9 g 0.2 g 1 000 mL A.6 封闭液 牛血清白蛋白（BSA） 4 5.0 g DB14/ T 1804—2019 氯化钠（NaCl） 氯化钾（KCl） 十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O） 磷酸二氢钾（KH2PO4） 硫柳汞钠 加蒸馏水至 8.0 g 0.2 g 2.9 g 0.2 g 0.2 g 1 000 mL A.7 酶标记物 羊抗猪IgG-HRP（辣根过氧化物酶标记抗体）（商品化） _________________________________ 5