ICS 65.020.30 B41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3086—2017 猪附红细胞体 PCR 检测技术 PCR Assay for Detection of Swine Eperythrozoon 2017 - 12 - 29 发布 山东省质量技术监督局 2018 - 01 - 29 实施 发 布 DB37/T 3086—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：陈蕾、杜以军、齐静、丛晓燕、孙文博、陈智、郭立辉、于江、吴家强、李俊、 时建立。 I DB37/T 3086—2017 猪附红细胞体 PCR 检测技术 1 范围 本标准规定了猪附红细胞体PCR检测技术的操作要求 本标准适用于猪附红细胞体的实验室诊断、监测和流行病学调查等。 2 实验室生物安全要求 实验室必须为生物安全Ⅱ级（BSL-2级）及以上实验室。 3 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 4 术语与定义 下列术语与定义适用于本标准。 4.1 PCR 聚合酶链式反应。 4.2 SDS 十二烷基硫酸钠。 5 仪器设备和试剂 5.1 仪器设备 5.1.1 微量移液器（最大量程分别为 10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL），带滤芯的枪头。 5.1.2 20000 r/min 低温高速离心机。 5.1.3 电热恒温水槽。 5.1.4 稳流稳压电泳仪。 5.1.5 水平电泳槽。 5.1.6 凝胶成像系统。 5.1.7 紫外透射反射分析仪。 5.1.8 电磁炉。 5.1.9 烧杯（1000 mL）。 1 DB37/T 3086—2017 5.1.10 5.1.11 5.1.12 5.1.13 电子天平 精度为：0.001 g。 PCR 扩增仪。 -20 ℃冰柜。 2 ℃～8 ℃冰箱。 5.2 试剂 除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。 5.2.1 蛋白酶 K（见附录 A.1）。 5.2.2 10 %SDS 液（见附录 A.2）。 5.2.3 70 %乙醇（见附录 A.3）。 5.2.4 1.0 %琼脂糖凝胶（见附录 A.4）。 5.2.5 DNA Marker DL2000。 5.2.6 超纯水：符合 GB/T 6682，三级。 5.2.7 引物： MS-Fwd：5-CGAGCGCAACCCTTCATAT-3； MS-Rev：5-CTACCATTGTAGCACGTTTGCA-3； 扩增片段大小127 bp。 6 操作程序 6.1 样品的采集和处理 6.1.1 样品的采集 临床上猪的血液（肝素抗凝血），置于2 ℃～8 ℃冰箱保存。 6.1.2 样品的处理 6.1.2.1 取肝素抗凝血液约 5 ml。 6.1.2.2 阳性对照处理：猪附红细胞体 DNA。 6.1.2.3 阴性对照处理：灭菌双蒸水。 6.2 DNA 的提取 用蛋白酶K裂解法提取总DNA。 6.2.1 取肝素抗凝血 500 μL 于 1.5 mL 离心管中，加入 50 μg/mL 的蛋白酶 K 5 μL，加入 10 %的 SDS 溶液 25 μL，55 ℃水浴 2 h～3 h。 6.2.2 加入 200 μL Tris 饱和酚，充分混匀，10000 g 离心 15 min。 6.2.3 取上清于一新的离心管中，加入 200 μL Tris 饱和酚和 200 μL 氯仿，10000 g 离心 15 min。 6.2.4 取上清于一新离心管中，加入 200 μL 氯仿，10000 g 离心 15 min。 6.2.5 取上清于一新离心管中，加入 2 倍体积的无水乙醇，-20 ℃静置 20 min，10000 g 离心 15 min， 弃上清。 6.2.6 加入 70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。 6.2.7 加入 100 μL 灭菌双蒸水溶解沉淀，-20 ℃保存备用。试验中同时设立猪附红细胞体 DNA 作为 阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。 6.3 PCR 2 DB37/T 3086—2017 PCR为50 μL体系，按表1中1～7的循序配制。 表1 PCR 反应体系（50μL） 序号 体系组成 体系含量 1 灭菌双蒸水 37.5 μL 2 DNA 4 μL 3 10 mmol/L上游引物 0.5 μL 4 10 mmol/L下游引物 0.5 μL 5 10×PCR Buffer 5 μL 6 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL 7 Taq酶 0.5 μL 首先加入双蒸灭菌水，然后按顺序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混悬， 瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。循环参数为95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min， 循环30次，72 ℃延伸10 min结束。 6.4 电泳 6.4.1 6.4.2 6.4.3 6.4.4 6.4.5 6.4.6 制备 1.0 %琼脂糖凝胶板，见附录 A.4。 取 5 μL PCR 产物与 0.5 μL 加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。 加入分子量标准。 盖好电泳仪，插好电极，5 V/cm 电压电泳，30～40 min。 用凝胶成像仪观察、扫描图片存档。 用分子量标准比较判断 PCR 片段大小。 7 结果判定 7.1 在阳性对照出现 127 bp 扩增带、阴性对照无此扩增带时，实验结果成立（参见附录 A.5）。 7.2 被检样品出现 127 bp 扩增带判定为猪附红细胞体阳性，未出现相应扩增带的样品判定为猪附红细 胞体阴性（参见附录 A.6）。 3 DB37/T 3086—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 蛋白酶K溶液（20 mg/mL） 试剂名称 用量 蛋白酶 K 100 mg 灭菌双蒸水 5 mL A.2 10%十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2） 试剂名称 用量 十二烷基硫酸钠 10 g 灭菌双蒸水 80 mL 浓盐酸 调 pH 至 7.2 灭菌双蒸水 加至 100 mL 试剂名称 用量 无水乙醇 70 mL 灭菌双蒸水 30 mL A.3 70 %乙醇 A.4 1.0%琼脂糖凝胶 试剂名称 用量 琼脂糖 0.6 g 0.5×TBE 缓冲液 60 mL _________________________________ 4