ICS 65.020.30 B41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3320—2018 水貂、狐和貉常见细菌实时荧光 PCR 检测 方法 Real-time fluorescent PCR for detecting of common bacterial pathogens of mink、fox and raccoon dog 2018 - 06 - 12 发布 山东省质量技术监督局 2018 - 07 - 12 实施 发 布 DB37/T 3320—2018 前 言 本标准按照GB/T 1．1 2009给出的规则起草。 本标准的附录为资料性附录。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心、山东大学生命科学学院。 本标准主要起草人：王贵升、张鹤晓、王金宝、田夫林。 I DB37/T 3320—2018 水貂、狐和貉常见细菌实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了水貂、狐和貉常见细菌（大肠杆菌、绿脓杆菌、克雷伯氏菌、嗜水气单胞菌、沙门氏 菌、柠檬酸杆菌、不动杆菌）实时荧光PCR检测方法。 本标准所适用于水貂、狐和貉的常见细菌的快速筛查和检测，其他动物细菌可参考本标准。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 GB/T 6682 3 4 分析实验室用水规格和实验方法 缩略语 荧光定量PCR Ct值 DNA 荧光定量聚合酶链式反应。 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环圈数。 脱氧核糖核酸。 Taq酶 PBS Taq DNA 聚合酶 磷酸盐缓冲生理盐水 试剂和材料 4.1 4.2 荧光定量 PCR 检测仪及配套反应管（板）。 高速台式冷冻离心机（离心速度 12 000 r/min 以上）。 4.3 4.4 4.5 混匀器。 恒温水浴锅。 冰箱（2 ℃～8 ℃和-20 ℃两种）。 4.6 4.7 微量移液器（0.5 L～10 L，5 L～20 L，20 L～200 L，200 L～1 000 L 及配套吸头。 1.5 mL 离心管（无核酸酶）。 4.8 可以选用经验证效果好的细菌 DNA 柱式提取试剂盒，或按照附录 A 配制试剂。 5 样品的采集与前处理 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。 5.1 取样工具 1 DB37/T 3320—2018 5.1.1 棉拭子、剪刀、镊子、研钵、Eppendorf 管。 5.1.2 所有上述取样工具必须经（121±2 ）℃，15 min 高压灭菌并烘干或经 160 ℃干烤 2 h。 5.2 采样方法 5.2.1 拭子样品 咽喉拭子采样，采样时要将拭子深入喉头及上腭来回刮3 次～5 次，取咽喉分泌液。 肛拭子采样，采样时要将拭子深入肛门回刮3 次～5 次，取排泄物。 5.2.2 内脏或肌肉样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0 g于研钵中充分研磨，再加5.0 mL PBS混匀，然后将组织悬 液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。 5.2.3 血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。 5.3 运送与存放 采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。 采集或处理的样本在2 ℃～8 ℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，须放置-70 ℃冰箱，但 应避免反复冻融（最多冻融3 次）。 6 引物及探针见表 1“荧光 PCR 方法的引物及探针”。 表1 大肠杆菌 克雷伯氏菌 绿脓杆菌 沙门氏菌 嗜水气单胞菌 不动杆菌 荧光 PCR 方法的引物及探针 F GTG TGA TAT CTA CCC GCT TCG C R AGA ACG GTT TGT GGT TAA TCA GGA Probe FAM-TCG GCA TCC GGT CAG TGG CAG T-MGB F TGAAACGACCTGATTGCATTCGAT R AGGCTGTCGGGATAAGCCA Probe HEX- CGCGCCACYGGAAGGGYATG-TAMRA F ACC CGARACG YAG GCT ATG R CAG GTC GGA GCT GTM CTA CTC Probe FAM-AGGTGGTGATCGCACGCAG-BHQ F GCCATGCTGTTCGATGAT R GTTACCGATAGCGGGAAAGG Probe FAM-TTTTGCACCACMGCCAGCCC-TAMRA F GCCGTCGAAACCAACGTAGA R CAACACCTGGTCCGGTATCG P FAM-CAGCAGAAACTTGCCACTCGGTCTTG-BHQ1 F GTTGTGGCTTTAGGTTTATTATACG R AAGTTACTCGACGCAATTCG 2 DB37/T 3320—2018 表1 荧光 PCR 方法的引物及探针 不动杆菌 Probe CY5-ACCCATCAAGGTAAAGGCTTCGTTCG-BHQ1 F TTGGCGTCCAGCGCATTCA R AATTCCAGCCTTCGGCAAACG Probe CY5-TCCAGATCGGAAAGGGTTGCGGTGAC-TAMRA 柠檬酸杆菌 7 （续） 操作方法 7.1 样本核酸的提取 7.1.1 细菌培养：取单克隆菌落接种于 5ml 液体培养基中，37 ℃摇床（300 rpm）培养过液。 7.1.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用 n 表示，取 n 个灭菌的 1.5 mL 离心管，逐管编号。 7.1.3 细菌收集：取 1 ml 培养物于 1.5 ml EP 管中,室温 8000 rpm 离心 5 min,弃上清，沉淀重新悬 浮于 ddH2O 中，弃上清。 7.1.4 裂解：菌体沉淀加入 6μ l 50 mg/ml 的溶菌酶，37 ℃作用 2 h。再加 5 mol/L NaCl 50μ l，10%SDS 110μ l，20 mg/ml 的蛋白酶 K 3μ l，50 ℃作用 3 h 或 37 ℃过夜（此时菌液应为透明粘稠液体）。 7.1.5 抽提：菌液均分到两个 1.5 ml EP 管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温 放置（5-10）min.12000 rpm 离心 10 min，抽提两次。（上清很粘稠,吸取时应小心）。 7.1.6 沉淀：加 0.6 倍体积的异丙醇，混匀，室温放置 10 min。12000 rpm 离心 10 min。 7.1.7 洗涤：沉淀用 75 %的乙醇洗涤。 7.1.8 抽（晾）干后,溶于 40μ l～60μ l ddH2O 中,取 2μ l～5μ l 电泳.作 PCR 模板用.获得的 DNA 溶 液，冰上保存备用（注意提取的 DNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增，若需长期保存须放置-70 ℃以下冰箱， 但应避免反复冻融）。 7.2 扩增试剂准备---在反应混合物配制区进行 可以用各细菌的检测试剂盒，也可合成引物探针后配制反应液。 7.2.1 室温温浴 PCR 反应液，2000 r/min 离心 5 sec； 7.2.2 准备 n 个洁净经无核酸酶的 PCR 反应管，设所需 PCR 管数为 n（n = 样本数 + 1 管阴性对照 + 1 管阳性对照）； 7.2.3 每个测试反应体系需要 15 μ L PCR 反应液和 0.3 μ L Taq 酶。计算好各试剂的使用量，加入一 适当体积离心管中，充分混合均匀，向每个 PCR 管中各分装 15 μ L，转移至样本处理区。 7.3 加样---在样品处理区进行 分别向上述PCR管中加入样本核酸提取步骤7.1.8中制备的DNA溶液各10μ L，使总体积达25 μ L。记 录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。 7.4 荧光 PCR 反应---在检测区进行 将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录PCR管摆放顺序。反应参数设置： 3 DB37/T 3320—2018 a) 第一阶段，预变性 92 ℃/3 min； b) 第二阶段，92 ℃ 15 sec，60 ℃ 60 sec，共 40 个循环，最后 40 ℃ 2 min。荧光收集在第 二阶段每次循环的退火延伸时进行。 8 结果判定 8.1 结果分析条件的设定 8.1.1 阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点 为准。 8.1.2 对于多通道荧光 PCR 仪，大肠杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌选定 FAM(465-510)检测通道读取检测 结果，ABI 仪器选择 FAM 无荧光淬灭基团；克雷伯氏菌选定 HEX 或 VIC 检测通道读取检测结果，ABI 仪 器选择 VIC 无荧光淬灭基团；不动杆菌和柠檬酸菌选定 CY5 检测通道读取检测结果。 8.2 质控标准 8.2.1 阴性对照选用 TE 溶液做模板。阴性对照无 Ct/Cp 值并且无扩增曲线。 8.2.2 阳性对照选用标准菌株提取核酸做模板。阳性对照的 Ct/Cp 值应小于等于 28，并出现典型的扩 增曲线。 8.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。 8.3 结果判定 8.3.1 阴性：无 Ct/Cp 值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性。 8.3.2 阳性：Ct/Cp 值≤30.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品为阳性。 8.3.3 Ct/Cp 值大于 30.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验。复验仍出现上述结果的，判为阳 性，否则判为阴性。 9 废弃物处理 实验检测过程中产生的废弃物严格按照实验室生物安全管理的要求进行处理并做好记录。 4 DB37/T 3320—2018 AA 附 录 A （规范性附录） 磷酸盐缓冲生理盐水配方 所用试剂均为分析纯以上。 A.1 0.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 溶液：称取 6.055 g Tris置于 100 mL烧杯中，加入 80 mL水，用 浓HCl调节pH值至 8.0，定容至 100 mL，高压灭菌后室温保存待用。 A.2 0.5 mol/L E