ICS 65.020.30 B41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3319—2018 水貂、狐和貉犬瘟热病毒等 10 种病毒性病 原实时荧光 PCR 检测方法 Real-time fluorescent PCR for detecting of distemper virus and other 10 viral pathogens of mink, fox and raccoon dog 2018 - 06 - 12 发布 山东省质量技术监督局 2018 - 07 - 12 实施 发 布 DB37/T 3319—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准的附录为资料性附录。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心、山东大学生命科学学院、威海市动物疫病 预防控制中心。 本标准主要起草人：王贵升、王金宝、田夫林、张鹤晓、崔凯、张月、张华杰。 I DB37/T 3319—2018 水貂、狐和貉犬瘟热病毒等 10 种病毒性病原实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了水貂、狐和貉犬瘟热病毒等10种病毒性病原实时荧光PCR检测方法。 本标准所规定的实验室检测方法适用于水貂、狐和貉的犬瘟热病毒、细小病毒、冠状病毒、轮状病 毒、星状病毒、阿留申病毒、杯状病毒、博卡病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒等10种病毒的荧光PCR检测 方法，其他动物参考。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 GB/T 6682 3 分析实验室用水规格和实验方法 4 缩略语 荧光PCR Ct值 实时荧光聚合酶链式反应 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环圈数 DNA RNA 脱氧核糖核酸 核糖核酸 Taq酶 PBS Taq DNA 聚合酶 磷酸盐缓冲生理盐水 试剂和材料 4.1 4.2 4.3 荧光定量 PCR 检测仪及配套反应管（板）。 高速台式冷冻离心机（离心速度 12000 r/min 以上）。 混匀器。 4.4 4.5 恒温水浴锅。 冰箱（2 ℃～8 ℃和-20 ℃两种）。 4.6 4.7 微量移液器（0.5 L～10 L，5 L～20 L，20 L～200 L，200 L～1 000 L）及配套吸头。 1.5 mL 离心管（无核酸酶）。 4.8 DNA\RNA 核酸提取试剂等。 5 样品的采集与前处理 1 DB37/T 3319—2018 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。 5.1 取样工具 5.1.1 5.1.2 5.2 棉拭子、剪刀、镊子、研钵、Eppendorf 管。 所有上述取样工具必须经（121±2 ）℃，15 min 高压灭菌并烘干或经 160 ℃干烤 2 h。 采样方法 5.2.1 a) 拭子样品 咽喉拭子采样，采样时要将拭子深入喉头及上腭来回刮 3 次～5 次，取咽喉分泌液。然后将 拭子插入到装有 1.0 mL PBS 无菌 Eppendorf 管中，编号备用。 b) 5.2.2 肛拭子采样，采样时要将拭子深入肛门回刮 3 次～5 次，取排泄物。然后将拭子插入到装有 1.0 mL PBS 无菌 Eppendorf 管中，编号备用。 内脏或肌肉样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0 g于研钵中充分研磨，再加5.0 mL PBS混匀，然后将组织悬 液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。 5.2.3 血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。 5.3 存放与运送 采集或处理的样本在2 ℃～8 ℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，须放置-70 ℃以下冰箱， 但应避免反复冻融（最多冻融3 次）。采集的样品密封后，采用保温设施加冰密封，尽快运送到实验室。 6 引物及探针 引物及探针见表1“荧光PCR方法的引物及探针”。 表1 荧光 PCR 方法的引物及探针 RNA 病毒 犬瘟热病毒 星状病毒 冠状病毒 杯状病毒 轮状病毒 细小病毒 F GCAAGCGAGGATTGAGGGTAT R GGCCTATGGGACACACTCAAA Probe FAM-CACCGACCATCCAGACGTTGCTCCT-BHQ F TCCAGGCATTTGAGTATGCC R CCACATAATCCTGGGGGA Probe FAM-CGGGAGTCGTGGGAC-BHQ F TGGGAC(T)TATCCT(A)AAG(A) TGTGA R TAA(G)CACACAACNCCATCATC Probe FAM-CGGGAGTCGTGGGAC-BHQ F CTGACTTCAAATTTCATCTC R TGGGAATTAAGTCAGAGG Probe FAM-ATCTATGCTCACTCATGGATCTGTC-BHQ F TTTATAGATAATGTATGTATGGATG R CCAATTCTCAATGTAATCAG Probe FAM-AATAGCCAGAGAATCAGAACGAA- BHQ F CGTCTACACAAGGGCCATTTA R CCATGTTGTCTACCAAATGCAT 2 DB37/T 3319—2018 表1 细小病毒 荧光PCR方法的引物及探针 Probe （续） FAM-CGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCA-BHQ DNA 病毒 博卡病毒 伪狂犬病毒 圆环病毒 阿留申病毒 7 F AGACGA CGCCTAGTTGTTTGGT R CAGTCCCTCCCAAGATACA CTTTG Probe FAM- AGGTTCCAC CCAATCCTGGTGCATTAAGC- BHQ F GCCAACCCGCTCGTGCTC R CACGAACACGCAGTCGCAGTA Probe FAM-GGCAGGTGCTGGGACTCGGGC- BHQ F CTCCCAATCTCCCTATTTGAT R ATCTGTTCCTTTCGCTTTCTC Probe FAM-ACACCCCACCTACAGGGGTTCGC -BHQ F ACCCTCCAGGTCAACTCTT R TTAGTAAATACACCAGGTTCTCC Probe FAM-TGAGTTCTCTTTTAACAGGATTCC-BHQ 7.1 操作方法 样本核酸 DNA 病毒的提取 在样本处理区进行。 7.1.1 在 1.5 ml 的 eppendorf 管中加入样品上清液 200 ul，加入 1 ml 的 DNA 提取细胞裂解液，25 µL 蛋白酶 K 混匀，56 ℃水浴 2 h，期间不时轻微摇匀。加入 10 µL RNA 酶，37 ℃酶解 1 h。 7.1.2 加入 200 ul 的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象）， 室温放置 10 min。 7.1.3 离心 4 ℃、12000 r/min、15 min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。 7.1.4 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置 10 min。 7.1.5 离心 4 ℃、12000 r/min、15 min，用移液器小心吸去所有上清。 7.1.6 加 1 ml 75 %乙醇洗一遍，离心 4 ℃、8000 r/min、10 min，用移液器小心吸去所有上清，重 复洗涤一次,在超净台中干燥 5 min。 7.1.7 加入 40μ l～60μ lTE 溶解 DNA，-20 ℃保存备用。 注1：可采用经验证的病毒 DNA/RNA 提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取 DNA/RNA。 7.2 样本核酸 RNA 病毒的提取 所提取物为血清、血液、细胞培养液、鸡胚尿囊液和动物组织等中的病毒。提取时尽量在人少时进 行，防止空气中 RNA 酶的污染。所用一切物品也应是无 RNA 酶的。 7.2.1 在 1.5 ml 的 eppendorf 管中加入样品上清液 200ul，再加入 TRIzol 1 ml，充分混匀，室温放 置 10 min。 7.2.2 加入 200 ul 的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象）， 室温放置 10 min。 7.2.3 离心 4 ℃、13000 r/min、15 min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。 7.2.4 7.2.5 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置 10 min。 离心 4 ℃、13000 r/min、15 min，用枪小心吸去所有上清。 3 DB37/T 3319—2018 7.2.6 加 1 ml75 %乙醇洗一遍，离心 4 ℃、8000 r/min、10 min，用枪小心吸去所有上清，重复此 步骤,在超净台中干燥 5 min。 7.2.7 加入 40μ l～60μ lTE 溶解 RNA，-20 ℃保存备用。 注2：可采用经验证的病毒 DNA/RNA 提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取 DNA/RNA。 7.3 扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行，不区分DNA病毒和RNA病毒。 7.3.1 室温温浴 PCR 反应液，2000 r/min 离心 5 sec； 7.3.2 准备 n 个洁净经无核酸酶的 PCR 反应管，设所需 PCR 管数为 n（n = 样本数 + 1 管阴性对照 + 1 管阳性对照）； 7.3.3 每个测试反应体系需要 15 μ L PCR 反应液和 0.3 μ L Taq 酶。计算好各试剂的使用量，加入一 适当体积离心管中，充分混合均匀，向每个 PCR 管中各分装 15 μ L，转移至样本处理区。 7.4 加样 在样品处理区进行，分别向上述PCR管中加入样本核酸提取步骤7.1中制备的DNA（或RNA）溶液各10 μ L，使总体积达25 μ L。盖紧管盖后，1000 r/min离心30 sec。 7.5 荧光 PCR 反应---在检测区进行 将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录PCR管摆放顺序。反应参数设置： 7.5.1 DNA 病毒： a) 第一阶段，