ICS 11.220 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3573—2019 牛支原体诊断技术规程 Code of Practice for the Diagnosis of Mycoplasma Bovis 2019 - 05 - 29 发布 山东省市场监督管理局 2019 - 06 - 29 实施 发 布 DB37/T 3573—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语与定义 ......................................................................... 1 4 试剂及仪器 ......................................................................... 1 4.1 试剂 ........................................................................... 1 4.2 仪器 ........................................................................... 2 5 样品采集与处理 ..................................................................... 2 5.1 疑似牛支原体感牛只的判断 ....................................................... 2 5.2 疑似病例样品的采集 ............................................................. 2 5.3 样品处理 ....................................................................... 2 6 微生物学检测法 ..................................................................... 2 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 液体培养 ....................................................................... 菌落形态观察 ................................................................... Dienes 染色 ..................................................................... 生化试验 ....................................................................... 结果判定 ....................................................................... 2 2 3 3 3 7 核酸检测法 ......................................................................... 3 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 DNA 模板的制备 .................................................................. PCR 检测 ........................................................................ 凝胶电泳 ....................................................................... 质量控制 ....................................................................... 结果判定 ....................................................................... 3 3 4 4 4 8 废弃物的处理和检测过程中安全措施 ................................................... 4 9 操作注意事项 ....................................................................... 5 附 录 A （规范性附录） 培养基的制备方法 ............................................ 6 I DB37/T 3573—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、中国农业科学院兰州兽医研究所、威海市畜牧 兽医局。 本标准主要起草人：张亮、杨宏军、解晓莉、孙阳阳、储岳峰、赵国清、程凯慧、楚会萌、刘来兴、 杨美。 II DB37/T 3573—2019 牛支原体诊断技术规程 1 范围 本标准规定了牛支原体诊断技术的术语和定义、试剂及仪器、样品的采集与处理方法、生化鉴定方 法、核酸检测方法和操作注意事项等。 本标准适用于牛支原体的实验室诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14926.8—2001 实验动物 支原体检测方法 GB 15981—1995 消毒与灭菌效果的评价方法与标准 GB 19489—2008 实验室生物安全通用要求 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛支原体 Mycoplasma bovis 柔膜菌纲支原体目支原体科支原体属，可引起成母牛乳腺炎、犊牛肺炎和关节炎等多种疾病的病原 之一。 3.2 Dienes 染色液 一种经典的利用天青美蓝染色检测支原体的染色液。 3.3 类胸膜肺炎微生物培养基 Pleuropneumonia-Like Organisms medium，PPLO培养基 该培养基主要成分为牛心汤、酵母浸出物、牛肉膏等，不含精氨酸、酚红、葡萄糖等成分，主要用 于多种支原体的分离和培养。 4 试剂及仪器 4.1 试剂 1 DB37/T 3573—2019 去离子水（符合GB 6682—2008的相应要求）；牛支原体检测培养基所需试剂及配制方法见附录A； Taq DNA聚合酶及其反应缓冲液；生理盐水；Dienes染色液；TAE电泳缓冲液；琼脂糖 4.2 仪器 接种环、酒精灯、移液器（5～100 μ L和100～1 000 μ L）、枪头（200 μ L和1 mL）、培养试管 （15 mL）和玻璃平皿（90 mm）、CO2恒温培养箱、移液器、1 L容量瓶、核酸扩增仪、电泳仪、高压灭 菌锅、正置光学显微镜。 5 样品采集与处理 5.1 疑似牛支原体感牛只的判断 5.1.1 肺炎型，主要表现为咳嗽、喘，有清亮或脓性鼻液，伴随出现关节炎或角膜结膜炎；不同病死 牛只的病变差异较大，通常病牛心叶及部分膈叶的局部红色肉变，或同时有化脓灶散在分布。 5.1.2 乳腺炎型，主要表现为临床型乳腺炎和隐性乳腺炎，前者乳汁带血或呈灰色，后者体细胞数较 高，无明显临床症状，但多数情况下单纯感染无明显的红肿热痛。 5.1.3 关节炎型，主要表现为犊牛膝关节肿大、跛行，关节炎淡黄色或浓稠，常与肺炎性伴随发生。 5.2 疑似病例样品的采集 根据“5.1”所述牛支原体感染的三种临床表现型，分别进行样品的采集，具体要求如下： a) 肺炎型：应采集新病死牛只的肺部实变部分或病牛的鼻腔液，置专用采样器或无菌容器中； b) 乳腺炎型：采集前，应弃病牛的前三把奶，再采集病牛乳汁约 15 mL，置注射器或无菌容器中； c) 关节炎型：对采集部位进行消毒后穿刺吸取关节液约 2 mL～5 mL，置注射器或无菌容器中。 5.3 样品处理 5.3.1 组织样品的处理 剪至云雾状后，用2 mL生理盐水重悬，7 500g离心5 min，用注射器吸取1 mL上清液经0.45 μ m滤 膜滤过后备用。 5.3.2 鼻拭子的处理 用2 mL生理盐水浸润拭子后，7 500 g离心5 min，吸取1 mL上清液经0.45 μ m滤膜滤过后备用。 5.3.3 奶样或关节液样品的处理 分别取1 mL原液与1 mL生理盐水充分混合，7 500 g离心5 min，用注射器吸取1 mL上清液经0.45 μ m滤膜滤过后备用。 6 微生物学检测法 6.1 液体培养 将0.5 mL“5.3”所述处理所得上清液加入到含4.5 mL PPLO液体培养基的试管中，置于37 ℃，5 % CO2培养箱中培养3天，选择PPLO液体培养基由红色变为黄色且透亮的培养液用于进一步检验。 6.2 菌落形态观察 2 DB37/T 3573—2019 取50 μ L疑似液体培养阳性的样品加入到PPLO固体培养基（配方见附录A）上，涂布均匀后，置于 37 ℃，5 % CO2培养箱中培养3～5天后，4倍物镜下观察菌落形态。 6.3 Dienes 染色 将有可疑菌落的固体培养基平皿进行Dienes染色，37 ℃孵育30 min后，观察菌落颜色。 6.4 生化试验 6.4.1 洋地黄皂苷敏感试验 将“6.1”中变为黄色的培养液，1:10接种于含0.2 mg/mL洋地黄皂苷的PPLO液体培养中，置于37 ℃， 5 % CO2培养箱中培养3天，观察培养基颜色变化。当培养基