ICS 11.220 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 3126—2018 禽波氏杆菌免疫荧光检测技术规范 Technical Guideline of Immunofluorescent Test of Bordetella avium 2018-02-02 发布 山东省质量技术监督局 2018-03-02 实施 发 布 DB37/T 3126—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准由山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心负责起草。 本标准主要起草人：朱瑞良、胡莉萍、魏凯、黄河、杨萍萍、孙振红、彭军、张华杰、万吉国。 I DB37/T 3126—2018 禽波氏杆菌免疫荧光检测技术规范 1 范围 本规范规定了禽波氏杆菌病间接免疫荧光检测技术的试剂或材料、仪器设备、禽波氏杆菌外膜蛋白 （OMP）的提取、禽波氏杆菌OMP含量测定、禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）抗血清的制备、阴性血清制备、 禽波氏杆菌免疫荧光检测方法和判定标准。 本规范适用于山东省境内从事家禽饲养以及从事家禽防疫活动的单位和个人禽波氏杆菌检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 14925 实验动物 环境及设施 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 蛋白定量Bradford法 Bradford method for protein quantitation 考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488 nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质— 色素结合物在595 nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量 测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2 min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温 下1 h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应灵敏，可测定微克级蛋白质含量。 3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分 开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污 剂和强还原剂（SDS，即十二烷基硫酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小 （可以忽略电荷因素），可以用于分离蛋白质和寡核苷酸。 3.3 免疫荧光试验 immunofluorescence test 1 DB37/T 3126—2018 是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理， 先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相 应抗原（或抗体）。 4 试剂或材料 4.1 禽波氏杆菌 禽波氏杆菌P5株，购自中国兽医药品监察所。 4.2 抗体 异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔IgG。 4.3 生化试剂 邻苯二胺(OPD)、聚乙二醇辛基苯基醚（Tri-tonX-100）、考马斯亮兰G-250、牛血清白蛋白（BSA）、 不完全弗氏佐剂、丙酮（分析纯）、乙醇（分析纯）、甘油（分析纯）。 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 超净工作台。 恒温培养箱。 超速冷冻离心机。 蛋白电泳仪。 微量移液器（20 μL～100 μL）。 电子天平。 超声波破碎仪。 旋涡混合器。 分光光度计（380 nm～780 nm）。 荧光显微镜。 6 禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）的提取 6.1 将保存的禽波氏杆菌株接种于 200 mL 肉汤培养基中，37 ℃振荡培养过夜后，离心收集过夜培养 的细菌。肉汤培养基配制按附录 A 执行。 6.2 用 10 倍体积的含有 10 mM MgCl 2 的 Tris-HCl（100 mM pH7.8）缓冲液悬浮，超声波破碎（功率为 500 W、破碎时间 60 s、间隙 60 s、反复破碎 10 次）。Tris-HCl 缓冲液配制按附录 A 执行。 6.3 通过 1000×g 低速离心去除细胞核，上清液高速离心，10000×g，20 min。 6.4 含全膜蛋白的沉淀，用同体积的含 2 % Triton X-100 的 Tris-MgCl 2 缓冲液溶解，室温下孵育 30 min 降解内膜蛋白后，再进行 100000×g，30 min 超速离心。 6.5 沉淀用缓冲液再悬浮，置-20 ℃保存备用。 6.6 SDS-PAGE 电泳检测禽波氏杆菌外膜蛋白 OMP 的分子量。 7 禽波氏杆菌 OMP 含量测定 2 DB37/T 3126—2018 7.1 考马斯亮蓝法 7.1.1 取 16 支试管，1 支作空白对照，3 支用于检测禽波氏杆菌 OMP 样品，其余 12 支试管分为两组， 每组 6 支，用于绘制标准曲线。 7.1.2 用移液器向每组 6 支试管中各加入 1.0 mg/mL 的标准蛋白质溶液各 0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL、 0.06 mL、0.08 mL、0.1 mL，然后用去离子水补充到 0.1 mL。 7.1.3 各试管中分别加入 5.0 mL 考马斯亮兰 G-250 试剂，立即在旋涡震荡器上混匀；空白对照管为 0.1 mL 水与 5.0 mL 考马斯亮兰 G-250 试剂的混合液。 7.1.4 加完试剂 2 min～5 min 后，用塑料或玻璃比色皿在分光光度计上测定各样品在 595 nm 处的吸 光值 OD 595 。 7.1.5 用标准蛋白质量（mg）为横坐标，吸光度值 OD 595 为纵坐标，绘制标准曲线。根据检测样品的 OD 595 值，计算样品中 OMP 的含量。 7.2 考马斯亮蓝微量法 7.2.1 样品中蛋白质浓度较稀时（10 mg/mL～100 mg/mL）采用微量法检测。 7.2.2 每支试管的蛋白溶液量加大到 1.0 mL，加考马斯亮蓝 G-250 试剂 5.0 mL，根据测定的 OD 595 值 绘制标准曲线，计算样品中禽波氏杆菌 OMP 的含量。 7.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 7.3.1 分别配制 SDS-聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶，安装垂直电泳装置。分离胶和浓缩胶配制按附录 A 执行。 7.3.2 用移液器将 OMP 样品加至加样孔，进行电泳。 7.3.3 电泳结束，用考马斯亮蓝 R250 对蛋白胶进行染色，检验禽波氏杆菌 OMP 的提取效果。 8 禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）抗血清的制备 8.1 将提取的禽波氏杆菌 OMP 蛋白液与弗氏不完全佐剂混合（V:V=1:1），用漩涡振荡器乳化，制备禽 波氏杆菌 OMP 免疫用抗原。. 8.2 选取体重 2.5 kg 的健康青紫兰家兔 4 只，颈背部皮下注射免疫 OMP 抗原，共免疫 4 次，每次间隔 1 周，OMP 免疫剂量为 320 μg/只/次。实验兔的饲养符合 GB 14925 的要求。 8.3 最后 1 次免疫后 7 d 采血，检测兔血清中禽波氏杆菌抗体的凝集价，凝集价高于 1:256 以上时采 血，分离血清，-20 ℃保存备用。 9 阴性血清制备 采集未免疫的健康青紫兰兔血液，制备阴性血清。 10 禽波氏杆菌免疫荧光检测方法 10.1 被检禽波氏杆菌涂片的制备 10.1.1 组织涂片的制备 3 DB37/T 3126—2018 取临床疑似禽波氏杆菌病的鸡肝脏组织进行涂片，自然干燥后，用冷丙酮固定15 min，用灭菌PBS （配制方法见附录A）洗涤3～4次，风干。 10.1.2 阴、阳性组织涂片的制备 用移液器吸取5 μL培养基培养的禽波氏杆菌菌液进行涂片，自然干燥后，用冷丙酮固定15 min，用 灭菌PBS洗涤3～4次，风干。正常肝脏组织涂片作为阴性对照。 10.2 检测方法 10.2.1 向涂片中滴加 1:10 倍稀释的禽波氏杆菌 OMP 抗血清 100 μL，置于 37 ℃湿盒中孵育 30 min， 用 PBS 洗涤 3 次。 10.2.2 加 1:100 倍稀释的异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗兔 IgG 二抗，置于 37 ℃湿盒中孵育 30 min，用 PBS 洗涤 3 次。 10.2.3 用吸水纸吸干后滴加甘油，将涂片置于荧光显微镜下观察。 11 判定标准 11.1 结果有效性 阳性对照呈现明显的黄绿色荧光，阴性对照无黄绿色荧光，则检测结果有效。 11.2 结果判定 荧光显微镜中出现黄绿色荧光，判为阳性，用“+”表示；未出现黄绿色荧光，判为阴性，用“–” 表示。阴阳性判定结果按附录B执行。 4 DB37/T 3126—2018 AA 附 录 A （资料性附录） 溶液的配制 A.1 SDS-PAGE电泳浓缩胶和分离胶的配制 A.1.1 5%浓缩胶配制 表A.1 5%浓缩胶配方 成分 配制不同体积 SDS-PAGE 浓缩胶所需各成分的体积（mL） 5%浓缩胶 2 3 4 6 8 10 水 1.4 2.1 2.7 4.1 5.5 6.8 30%Acr-Bis（29:1） 0.33 0.5 0.67 1.0 1.3 1.7 1M Tris（pH6.8） 0.25 0.38 0.5 0.75 1.0 1.25 10%SDS 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1 10%过硫酸铵 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1 TEMED 0.002 0.003 0.004 0.006 0.008 0.01 A.1.2 12%分离胶配制 表A.2 12%分离胶配方 成分 配制不同体积 SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积（mL） 12%分离胶 5 10 15 20 30 50 水 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 10.0 30%Acr-Bis（29:1） 2.0 4.0 6.0 8.0 12.0 20.0 1.5M Tris（pH8.8） 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.0 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0