65.020.30 ICS B41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3129.1—2018 鸭细小病毒感染诊断技术 第 1 部分：病毒 分离鉴定 Diagnostic techniques for duckparvovirus infection Part 1：Isolation and identification of duckparvovirus 2018 - 02- 02 发布 山东省质量技术监督局 2018 - 03 - 02 实施 发 布 DB37/T 3129.1—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东农业大学。 本标准起草人：刁有祥、陈浩、唐熠、杨晶。 I DB37/T 3129.1—2018 鸭细小病毒感染诊断技术 第 1 部分：病毒分离鉴定 1 范围 本标准规定了鸭细小病毒样品的采集与保存、病毒的分离和鉴定等的技术要求。 本标准所规定的鸭细小病毒分离鉴定和PCR检测方法适用于鸭组织、分泌物、排泄物和病毒培养物 中鸭细小病毒分离鉴定及其核酸检测。PCR方法还适用于该病的的实验室诊断、监测和流行病学调查等。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫 3 术语和定义 下列定义和术语适用于本文件。 3.1 鸭细小病毒 Duck parvovirus 也称新型鹅细小病毒，是引起鸭短喙侏儒综合征的病原，该病以生长障碍，短喙、舌外露为特征。 3.2 间接免疫荧光试验 Indirect immunofluorescence assay （IFA） 用对应某一种抗原的抗体(这里被称为一抗)与细胞孵育结合，在采用对应一抗(也就是抗一抗)的抗 体(这里被称为二抗，二抗上偶联有荧光素分子)与细胞孵育结合后在荧光显微镜下观察，出现绿色荧光 信号为阳性反应。 3.3 原代鸭胚肝细胞 Duck embryo liver cell （DEL） 采用胰酶消化法，用15日龄~20日龄SPF鸭胚肝脏制备的原代细胞。 4 实验室质量控制 4.1 实验室符合 GB 19489 和 GB/T 27401 要求，实验室必须为生物安全Ⅱ级（BSL-2 级）及以上实验 室。 1 DB37/T 3129.1—2018 4.2 从事 PCR 工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电泳 检测区，尽可能形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处 理，避免对实验室造成污染。病毒分离区域的鸡胚接种操作区和细胞培养操作区也应遵循一定的布局原 则，避免交叉污染。 4.3 注意个人防护和环境保护，电泳中用到的 EB 可诱发基因突变，试验中被 EB 污染的物品要有专用 收集处，并通过适当的方式（如焚烧、或送有资质的医用垃圾处理公司）进行无害化处理。 4.4 生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后，送有资质的医用 垃圾处理公司做最终处理。 4.5 人员 操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。 熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术。 4.5.1 仪器设备 a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) m) n) 生物安全柜； PCR 仪； CO 2 恒温培养箱（37 ℃恒温）； 台式低温高速离心机（最大转速 12000 r/min）； 电泳仪； 电泳槽； 紫外凝胶成像仪； 2°C～8°C 冰箱； -20°C 冰柜； 微量移液器（最大量程分别为 10μL、20μL、100μL、1000 μL），带滤芯的枪头； 孵化器（37℃恒温）； 水平摇床； 电子天平精度为：0.001 g； 电磁炉或微波炉。 4.5.2 试剂和材料 a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) m) DNA 提取试剂盒； rTaqDNA 聚合酶(5 U/μL)； 10×PCR Buffer； dNTPs（2.5 mmol/L）； 1.5 %琼脂糖凝胶，见 A.1； 1×TAE 缓冲液，见 A.2； 溴化乙锭（10μg/μL），见 A.3； 核酸电泳加样缓冲液，见 A.4； DNA 分子量标准，要求在 100 bp～2000 bp 之间，有 5 条以上的指示条带； 已知的鸭细小病毒液阳性对照标准品； 健康鸭组织或细胞作为阴性对照标准品； 固定液，甲醇：丙酮=1:1（V/V）； FITC 标记的鼠抗兔荧光抗体； 2 DB37/T 3129.1—2018 细胞培养液（含 10 %胎牛血清的 DMEM 培养基）； o) 兔抗鸭细小病毒多克隆抗体； p) 细胞维持液（含 1 %胎牛血清的 DMEM 培养基）； q) SPF 鸭胚； r) PCR 检测引物： 上游引物5455F：5’-GAGCATCAACTCCCGTATGTCC-3’； 下游引物5371R：5’-CTACTTCCTGCTCGTCCGTGA-3’； 扩增目的片段长度为661 bp；引物浓度均为50μmol/L。 n) 5 样品的采集和处理 5.1 样品的采集 采集死亡鸭肝脏、脾和脑等组织，分别处理或混合后进行处理；若是活鸭，则采集泄殖腔拭子。样 品置于在密闭容器中冷藏运输，储藏温度不超过4℃，时间不超过24h。 5.2 样品的保存 5.2.1 室温条件下样品在 1 h～2 h 内处理完毕，未能及时处理的样本在 4 ℃冰箱中存放，不超过 24 h； 也可于-20 ℃低温条件下保存，不超过 30 d；-70 ℃贮存最佳，不超过 1 年。 5.2.2 组织研磨液和泄殖腔拭子悬液置于-20 ℃低温条件下保存，不超过 2 周；-70℃贮存不超过 30 d。 5.3 样品的处理 5.3.1 在生物安全柜中，取 10 g～20 g 样品放入灭菌的研钵中，无菌条件下磨碎。 5.3.2 用含有抗生素（青霉素(2000 IU/mL)、链霉素(2 mg/mL)、庆大霉素（50μg/mL）和制霉菌素(1000 IU/mL)）等渗磷酸盐缓冲液（PBS，pH 值 7.0～7.4，附录 A.1）配成 10 %～20 % (g/mL)的悬液；泄殖 腔拭子悬液中抗生素浓度提高 5 倍。加入抗生素后 pH 调至 7.0～7.4。 5.3.3 样本组织悬液反复冻融 3 次，经 8000 r/min 离心 10 min，取上清并置 4 ℃过夜，次日接种 SPF 鸭胚或原代鸭胚肝细胞。 6 病毒分离 6.1 鸭胚接种 6.1.1 将处理后的样品上清，每份尿囊腔接种 9 日龄～11 日龄 SPF 鸭胚 3 枚～5 枚，0.2 mL/胚，37 ℃ 孵化 120 h。 6.1.2 弃去 24 h 内死亡胚，24 h～120 h 内死亡和存活鸭胚置 4 ℃冰箱过夜或-20 ℃冷冻 1 h，分别 无菌收集尿囊液并进行无菌检查，无菌尿囊液盲传三代。 6.2 细胞接种 6.2.1 将处理后的样品上清接种 80 %生长状况良好的单层原代鸭胚肝细胞，5 %CO 2 、37 ℃孵育 1 h， 吸弃上清，用 PBS 缓冲液轻轻洗涤 2 次，吸弃后加入细胞维持液。 6.2.2 当 70 %以上单层细胞出现细胞病变时，将细胞培养物冻融后，转移至 2 mL 冻存管置于-70 ℃ 保存，不超过 3 年。 3 DB37/T 3129.1—2018 7 病毒鉴定 7.1 间接免疫荧光法（IFA） 7.1.1 细胞的固定 取接种病毒60 h的鸭胚肝细胞（24孔细胞培养板），用PBS缓冲液轻轻洗涤3次～4次，吸弃液体。 加入预冷（-20 ℃）的甲醇：丙酮（1:1）固定液150μL/孔没过单层细胞，置于-20 ℃固定10 min，吸 弃固定液，自然晾干后，用PBS缓冲液洗涤3 次。 7.1.2 一抗孵育 将兔抗细小病毒多克隆抗体用抗体稀释液（PBST，见附录B.3）作1:200稀释，每孔加入100μL，置 于湿盒中37 ℃孵育1 h。吸弃后用PBS洗涤3 次。 7.1.3 二抗孵育 加入1:200（抗体稀释液PBST）稀释的FITC标记鼠抗兔抗体（100μL/孔），置于湿盒中4 ℃孵育1 h。 吸弃后用PBS缓冲液洗涤3 次。注意避光操作。 7.1.4 封片观察 加入数滴50 %甘油盐水封片（见附录B.2），置于倒置荧光显微镜下，观察是否有绿色荧光信号。 7.2 PCR 检测 7.2.1 DNA 提取 用DNA提取试剂盒， 并按试剂盒说明， 提取样品和对照的DNA。提取的DNA应随时检测，否则应于-20 ℃ 冻存。 7.2.2 PCR 反应 7.2.2.1 以提取的样品 DNA 为模板，用 PCR 进行扩增。 7.2.2.2 PCR 反应体系：10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（2.5mmol/L）2μL、引物 5455F（100μmol/L） 和 5861R（100μmol/L）各 0.5μL、DNA 模板 3μL、rTaq DNA 聚合酶 0.25μL，加 H2O 至 25μL。 7.2.2.3 PCR 反应条件：94 ºC 预变性 5 min；94 ℃ 30 s、58 ℃45 s、72 ℃ 30 s，进行 30 个循环， 72 ℃延伸 10 min。 7.2.3 PCR 产物电泳 7.2.3.1 取 9μL 样品与 1μL 核酸电泳加样缓冲液混匀后，于 1.5 %琼脂糖凝胶中电泳，在位于凝胶 中央的孔加入 DNA 分子量标准。 7.2.3.2 加样后，按照 5 V/cm 电压，电泳 20 min～40 min，当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶 下 2/5 处时，可停止电泳。 7.2.3.3 置于凝胶成像仪下观察，根据分子量标准判断 PCR 扩增产物大小。 7.2.4 对照设置 每次检测，至少设置一个或一个以上的阴性对照标准品和阳性对照标准品。 8 结果判定 8.1 鸭胚肝细胞感染鸭细小病毒，细胞轻微聚集，IFA 检测出现绿色荧光信号。当阳性对照 IFA 检测 显示出现绿色荧光信号，阴性对照未出现荧光信号时，检测结果成立，见资料性附录 C。 8.2 样品检测孔出现绿色荧光信号表明样品中存在鸭细小病毒，阴性样品中无鸭细小病毒。 4 DB37/T 3129.1—2018 8.3 阳性对照出现预期长度的