ICS 11.220 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3624—2019 牛场气溶胶结核分枝杆菌复合群荧光定量 PCR 检测技术规程 Detection of Mycobacterium tuberculosis complex pathogenic organisms in aerosol of cattle farm by Real-time PCR 2019 - 07 - 23 发布 山东省市场监督管理局 2019 - 08 - 23 实施 发 布 DB37/T 3624—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 缩略语 ............................................................................. 1 5 原理 ............................................................................... 1 6 材料及设备 ......................................................................... 1 6.1 试剂 ........................................................................... 2 6.2 仪器设备 ....................................................................... 2 7 生物安全措施 ....................................................................... 2 8 气溶胶样品的采集、保存及运输 ....................................................... 2 8.1 气溶胶样品的采集 ............................................................... 2 8.2 气溶胶样品的采集后的灭活处理 ................................................... 2 8.3 样品的保存和运输 ............................................................... 2 9 操作方法 ........................................................................... 2 9.1 气溶胶样本的前处理 ............................................................. 2 9.2 核酸提取 ....................................................................... 3 9.3 荧光定量 PCR 检测 ............................................................... 3 10 分析条件设定和结果判定 ............................................................ 3 10.1 阈值设定 ...................................................................... 3 10.2 质控 .......................................................................... 3 10.3 结果分析及判定 ................................................................ 3 11 注意事项 .......................................................................... 3 附 录 A （资料性附录） 主要仪器设备 ................................................ 4 附 录 B （规范性附录） 牛场环境气溶胶样本的采集方法和注意事项 ...................... 5 附 录 C （资料性附录） 气溶胶结核分枝杆菌复合群核酸荧光定量 PCR 检测结果图 .......... 7 附 录 D （规范性附录） 检测过程防止交叉污染的措施 .................................. 9 I DB37/T 3624—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东师范大学。 本标准主要起草人：王洪梅、何洪彬、赵贵民、侯佩莉、潘伟、何成强、于志君。 II DB37/T 3624—2019 牛场气溶胶结核分枝杆菌复合群荧光定量 PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了牛场环境气溶胶样本中结核分枝杆菌复合群核酸实时荧光定量PCR检测方法的技术要 求和操作规范。 本标准适用于牛场环境中气溶胶结核分枝杆菌复合群核酸的快速准确检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 Ct值 Cycle Threshold 荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 MTC：结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝杆菌（M.tuberculosis）、牛分枝杆菌（M.bovis）、非 洲分枝杆菌（M.africanum）、坎纳分支杆菌（M.canettii）等（Mycobacterium tuberculosis complex） AGI：全玻璃液体冲击式采样器（All-Glass-Impinger） 5 原理 本标准采用SYBR Green I染料实时荧光定量PCR技术。 MTC细菌的分泌性蛋白MBP70基因非常保守，因此以它为目的基因设计引物，可以对结核病病原进行 检测。 6 材料及设备 1 DB37/T 3624—2019 6.1 试剂 6.1.1 试剂级别 检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682的要求。 6.1.2 引物序列 上游引物（MTC-F）：5’-TGACCAGCATCCTGACCTACC-3’。 下游引物（MTC-R）：5’-CGGCGTTACCGACCTTGA-3’。 引物在使用时用灭菌双蒸水稀释成10 μ mol/L工作液，置于-20 ℃保存。 6.1.3 主要组分 SYBR Green I荧光定量PCR反应缓冲液，采用商品化试剂。 6.1.4 对照设置 阳性对照为灭活BCG疫苗菌株提取的基因组DNA，-20 ℃保存备用。阴性对照为采集自无结核病病原 污染的净化健康牛场气溶胶样本提取的基因组DNA。 6.2 仪器设备 仪器设备及参数见附录A。 7 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测结核分枝杆菌复合群核酸，所有检测样 本应在Ⅱ级生物安全柜内操作。 8 气溶胶样品的采集、保存及运输 8.1 气溶胶样品的采集 应用空气微生物采样箱，使用国际标准的AGI采集样本。采集方法和注意事项见附录B。 8.2 气溶胶样品的采集后的灭活处理 样品采集后立即用70%乙醇溶液灭活处理。 8.3 样品的保存和运输 待检样品在2 ℃～8 ℃保存不应超过24 h；-20 ℃保存不超过三个月；-80 ℃以下可长期保存。样 品应置于低温（2 ℃～8 ℃）、密封的容器内运输。 9 操作方法 9.1 气溶胶样本的前处理 取30 mL采集的气溶胶样本，12 000 r/min离心10 min，弃上清，重悬沉淀物，继续进行核酸提取， 或置-20 ℃备用。 2 DB37/T 3624—2019 9.2 核酸提取 采用商品化细菌基因组DNA提取试剂盒进行核酸提取。 9.3 荧光定量 PCR 检测 9.3.1 反应液的配制 采用20 μ L反应体系，每个反应管包含荧光定量PCR反应液（2×）：10.0 μ L，上、下游引物各0.8 μ L，检测模板或阴阳性对照2 μ L，灭菌蒸馏水6.4 μ L。需要配制的荧光定量PCR反应液管数为样品个 数n+2（阳性对照）+2（阴性对照）+ 2（防止分装时液体损失）。按照顺序依次加入上述各荧光定量PCR 反应组份的预混液，然后在每个PCR反应管中分装18 μ L。 9.3.2 加样 在已分装有荧光PCR预混液的PCR光学管中每管分别加入2 μ L待检样品或对照模板，混匀，盖上管 盖，放入荧光PCR仪，记录样品放置顺序。 9.3.3 荧光定量 PCR 扩增 选择检测模式：SYBR Green I。反应体系：20 μ L。反应条件设定：预变性：95 ℃ 30 s，1个循 环；PCR扩增：95 ℃ 5 s，61 ℃ 30 s，40个循环，6 1 ℃时采集荧光信号。熔解：95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min，95 ℃，Continuous；40 ℃ 10s。可根据不同品牌PCR仪器说明书等效设置参数