ICS 11.220 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3673—2019 牡蛎疱疹病毒 І 型检测技术规范 法 巢式 PCR Ostreid herpesvirus-1 Detection Specification- Nested PCR 2019 - 08 - 30 发布 山东省市场监督管理局 2019 - 09 - 30 实施 发 布 DB37/T 3673—2019 目 前 次 言 ............................................................................ II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和缩略语 ....................................................................... 1 3.1 术语和定义 ..................................................................... 1 3.2 缩略语 ......................................................................... 1 4 试剂及仪器 ......................................................................... 1 4.1 试剂 ........................................................................... 2 4.2 仪器 ........................................................................... 2 5 采样 ............................................................................... 3 5.1 采样对象 ....................................................................... 3 5.2 采样数量、方法和保存运输 ....................................................... 3 5.3 样品的采集 ..................................................................... 3 6 检测 ............................................................................... 3 6.1 DNA 的提取 ...................................................................... 3 6.2 巢式 PCR 操作步骤 ............................................................... 3 6.3 电泳及测序 ..................................................................... 4 7 结果 ............................................................................... 4 7.1 结果判定 ....................................................................... 4 7.2 结果表述 ....................................................................... 4 附 录 A （规范性附录） 试剂及配制方法 .............................................. 5 附 录 B （资料性附录） 检测目的片段的 DNA 序列及电泳图 .............................. 7 I DB37/T 3673—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。 本标准由山东省渔业标准化技术委员会(鲁TC 03)归口。 本标准起草单位：山东农业大学、济宁滨阳生物科技股份有限公司、泰安益海生物科技有限公司、 泰安智博生物科技有限公司、南京根洋生物科技有限公司、南京少伯生物科技有限公司、南京福海生物 科技有限公司。 本标准起草人：王雪鹏、丁雷、闫现广、王方鹏、郭志明、孙永灿、付天增、姜衡、黄金菁。 II DB37/T 3673—2019 牡蛎疱疹病毒 І 型检测技术规范 巢式 PCR 法 1 范围 本标准规定了牡蛎疱疹病毒І型（Ostreid herpesvirus-1，OsHV-1）的巢式PCR检测方法，适用于 对贝类样品进行疱疹病毒І型带毒情况的定性检测，以进行牡蛎疱疹病毒І型的流行病学调查、诊断、检 疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7205.1 牡蛎包纳米虫病诊断规程 3 术语和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 牡蛎疱疹病毒І型 牡 蛎 疱 疹 病 毒І型 属 于 软 体 动 物 疱 疹 病 毒 科 （ Malacoherpesviridae ） 、 牡 蛎 疱 疹 病 毒 属 （Ostreavirus），是一种双链DNA病毒，在世界范围内广泛流行，主要危害牡蛎、扇贝和魁蚶等多种双 壳贝类，对贝类养殖业造成重大的损害。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（base pair） dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） EB：溴化乙啶（ethidium bromide） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） Taq：水生栖热菌（thermus aquaticus） TE：Tris盐酸和EDTA缓冲液（EDTA Tris·HCl） Tris：三羟甲基氨基甲烷（tris hydroxymethyl aminomethane） 4 试剂及仪器 1 DB37/T 3673—2019 4.1 试剂 4.1.1 除非另有说明，实验用水均为 GB/T 6682 规定的三级水或相当纯度的水。 4.1.2 无水乙醇：分析纯。 4.1.3 TE 缓冲液按附录 A.1 的规定。 4.1.4 抽提缓冲液按附录 A.2 的规定。 4.1.5 蛋白酶 K 按附录 A.3 的规定。 4.1.6 10 mol/L 乙酸铵按附录 A.4 的规定。 4.1.7 Tirs 饱和酚（pH≥7.8）：分析纯。 4.1.8 4.1.8 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)：分析纯。 4.1.9 4.1.9 氯仿/异戊醇(24:1)：分析纯。 4.1.10 50×TAE：见附录 A.5，也可以直接购买市售产品。 4.1.11 1×TAE：见附录 A.5。 4.1.12 70 %乙醇按附录 A.6 的规定。 4.1.13 dNTP（各 2.5 mmol/L）：生化试剂，含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 2.5 mmol/L 的混合物， -20 ℃保存，用于 PCR。 4.1.14 10×PCR 反应缓冲液：见附录 A.7，也可以直接购买市售产品。 4.1.15 MgCl2 (25 mmol/L)：生化试剂，-20 ℃保存。 4.1.16 Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)：生化试剂，-20 ℃保存。 4.1.17 外引物 CF：5’-ATTACCCAGATTCCCCTC-3’，-20 ℃保存。 4.1.18 外引物 CR：5’-CCACAAATGTAAACTGTGAC-3’，-20 ℃保存。 4.1.19 内引物 C3：5’-GTGTTCTATACCATACGACCTACA-3’，-20 ℃保存。 4.1.20 内引物 C2：5’-TTGCGTTCCGTGACTTCT-3’-20 ℃保存。 4.1.21 PCR 检测阳性对照：已知受牡蛎疱疹病毒 І 型感染的贝类组织样品，-80 ℃保存。 4.1.22 PCR 检测阴性对照：已知未受牡蛎疱疹病毒 І 型感染的贝类组织样品，-80 ℃保存。 4.1.23 PCR 检测空白对照以灭菌双蒸水作模板。 4.1.24 琼脂糖：分析纯。见附录 A.8。 4.1.25 6×Loading Buffer：附录 A.9，也可以直接购买市售产品。 4.1.26 DNA 分子量标准。 4.1.27 溴化乙锭（EB）：分析纯，10 mg/mL，见 A.10，或其他等效产品。 4.2 仪器 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6 4.2.7 4.2.8 4.2.9 4.2.10 4.2.11 离心机。 PCR 仪。 电泳仪。 水平电泳槽。 凝胶成像系统或紫外仪。 多功能振荡器。 水浴锅或金属浴。 -20 ℃普通冰箱。 –80 ℃超低温冰箱。 微波炉电炉或其他加热设备。 微量移液器：量程 0.5 μL～1 000 μL。 2 DB37/T 3673—2019 5 采样 5.1 采样对象 牡蛎、扇贝和魁蚶等易感双壳贝类。 5.2 采样数量、方法和保存运输 采样数量、方法和保存运输应符合SC