ICS 11.220 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3625—2019 牛羊养殖场气溶胶布鲁氏菌荧光定量 PCR 鉴别检测技术规程 Differential detection of Brucella pathogenic organisms in aerosol of cattle and sheep farm by Real-time PCR 2019 - 07 - 23 发布 山东省市场监督管理局 2019 - 08 - 23 实施 发 布 DB37/T 3625—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语与定义 ......................................................................... 1 4 缩略语 ............................................................................. 1 5 原理 ............................................................................... 1 6 材料及设备 ......................................................................... 1 6.1 试剂 ........................................................................... 1 6.2 仪器设备 ....................................................................... 2 7 生物安全措施 ....................................................................... 2 8 气溶胶样品的采集、保存及运输 ....................................................... 2 8.1 气溶胶样品的采集 ............................................................... 2 8.2 气溶胶样品的采集后的灭活处理 ................................................... 2 8.3 样品的保存和运输 ............................................................... 2 9 操作方法 ........................................................................... 2 9.1 气溶胶样本的前处理 ............................................................. 2 9.2 核酸提取 ....................................................................... 3 9.3 荧光定量 PCR 检测 ............................................................... 3 10 分析条件设定和结果判定 ............................................................ 3 10.1 阈值设定 ...................................................................... 3 10.2 质控 .......................................................................... 3 10.3 结果分析及判定 ................................................................ 3 11 注意事项 .......................................................................... 4 附 录 A （资料性附录） 主要仪器设备 ................................................ 5 附 录 B （规范性附录） 牛羊养殖场环境气溶胶样本的采集方法和注意事项 ................ 6 附 录 C （资料性附录） 气溶胶布鲁氏菌核酸荧光定量 PCR 鉴别诊断结果图 ................ 8 附 录 D （规范性附录） 检测过程防止交叉污染的措施 ................................. 11 I DB37/T 3625—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东师范大学。 本标准主要起草人：何洪彬、赵贵民、王洪梅、侯佩莉、马文青、何成强、程凯慧、杨宏军、张亮、 解晓莉。 II DB37/T 3625—2019 牛羊养殖场气溶胶布鲁氏菌荧光定量 PCR 鉴别检测技术规程 1 范围 本标准规定了牛羊养殖场环境气溶胶样本中布鲁氏菌核酸荧光定量PCR鉴别诊断方法。 本标准适用牛羊养殖场环境中气溶胶布鲁氏菌核酸的检测以及牛种、羊种和猪种布鲁氏菌核酸的鉴 别检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 Ct值 Cycle Threshold 荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AGI：全玻璃液体冲击式采样器（All-Glass-Impinger） 5 原理 本标准采用SYBR Green I染料实时荧光定量PCR技术。 布鲁氏菌IS711（Insertion Sequence 711，IS711）插入序列在不同种的布鲁氏菌基因组中高度保 守，仅在拷贝数上存在差异。一条引物锚定在IS711上，另一条引物分别选在不同种布鲁氏菌IS711插入 序列邻近的上下游单染色体DNA上，可以用来鉴别布鲁氏菌种的特异性。 6 材料及设备 6.1 试剂 6.1.1 试剂级别 1 DB37/T 3625—2019 检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682的要求。 6.1.2 引物序列 通用型上游引物（Brucella-F）：5’-TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3’。 通用型下游引物（Brucella-R）：5’-TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3’。 牛种上游引物（Abortus-F）：5’-ACCATTGAAGTCTGGCGAGCA-3’。 羊种上游引物（Melitensis-F）：5’-TCGCTGTCACTGTTGCAAGTATG-3’。 猪种上游引物（Suis-F）：5’-AAAGGGAGTGGGTTCTAGGGCG-3’。 牛、羊和猪种下游共用IS711-R：5’-GACCGCATTCATGGGTTTCG-3’。 引物在使用时用灭菌双蒸水稀释成10 μ mol/L工作液，置于-20 ℃保存。 6.1.3 主要组分 SYBR Green I荧光定量PCR反应缓冲液，采用商品化试剂。 6.1.4 对照设置 阳性对照均为疫苗株灭活后提取的核酸样本，有牛种布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA、羊种布鲁氏菌 M5疫苗株基因组DNA和猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组DNA，-20 ℃保存备用。阴性对照为采集自无布鲁氏 菌污染的净化健康牛场气溶胶样本提取的基因组DNA。 6.2 仪器设备 仪器设备及参数见附录A。 7 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测布鲁氏菌核酸，所有检测样本应严格在 Ⅱ级生物安全柜内操作。 8 气溶胶样品的采集、保存及运输 8.1 气溶胶样品的采集 应用空气微生物采样箱，使用国际标准的AGI采集样本。采集方法与注意事项见附录B。 8.2 气溶胶样品的采集后的灭活处理 样品采集后立即用2%石碳酸溶液灭活处理。 8.3 样品的保存和运输 待检样品在2 ℃～8 ℃保存不应超过24 h；-20 ℃保存不超过三个月；-80 ℃以下可长期保存。样 品应置于低温（2 ℃～8 ℃）、密封的容器内运输。 9 操作方法 9.1 气溶胶样本的前处理 2 DB37/T 3625—2019 取30 mL采集的气溶胶样本，12 000 r/min离心10 min，弃上清，重悬沉淀物，继续进行核酸提取， 或置-20 ℃备用。 9.2 核酸提取 采用商品化细菌基因组DNA提取试剂盒进行核酸提取。 9.3 荧光定量 PCR 检测 9.3.1 反应液的配制 采用20 μ L反应体系，每个反应管包含荧光定量PCR反应液（2×）：10.0 μ L，上、下游引物各0.8 μ L，灭菌蒸馏水6.4 μ L，检测模板与阴、阳性对照分别为2 μ L。需要配制的荧光定量PCR反应液管数 为样品个数n+2（阳性对照）+ 2（阴性对照）+2（防止分装时液体损失）。按照顺序依次加入上述各荧 光定量PCR反应组份的预混液，然后在每个PCR反应管中分装18 μ L。 9.3.2 加样 在已分装有荧光PCR预混液的PCR反应管中每管分别